第十章 生殖毒理學

第十章生殖毒理學

衛(wèi)生毒理學教研室2004.5第一節(jié)概述

哺乳動物的生育繁殖過程外源化學物對生殖發(fā)育的影響外源化學物對生殖發(fā)育的影響以及損害作用的特點

哺乳動物的生育繁殖過程

生殖發(fā)育是哺乳動物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細胞發(fā)生，即精子發(fā)生和卵細胞發(fā)生、配子的釋放、性周期和性行為、卵細胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。概述外源化學物對生殖發(fā)育的影響干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內分泌功能也有調節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程。

概述外源化學物對生殖發(fā)育損害作用的特點

生殖發(fā)育過程較機體其他系統(tǒng)更為敏感外源化學物對生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠

概述術語基本概念生殖毒理學(reproductivetoxicology)主要研究外源化學物對生殖細胞發(fā)生、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用及其評定，評定方法即為生殖毒性試驗。發(fā)育毒理學(developmentaltoxicology)主要研究外源化學物對胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響及其評定，評定方法稱為發(fā)育毒性試驗，其中主要為致畸試驗。

概述第二節(jié)生殖毒性及其評定

生殖毒理學歷史生殖毒性生殖毒性的評價

生殖毒理學歷史1950年美國霍普金斯大學醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形。1956年用于治療妊娠反應的反應停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成的大面積污染及其與人群生殖危害的關系至今仍不清楚。

生殖毒性及其評定生殖毒理學歷史過去半個世紀震驚全球的系列中毒或災難事件的發(fā)生，在世界范圍內提高了人們對用藥的安全意識，高度關注新的化學物對生殖內分泌系統(tǒng)或妊娠結局的不良影響，促進了與生殖內分泌系統(tǒng)安全相關法律的產生和研究方法指南的問世。

生殖毒性及其評定生殖毒性

外源化學物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。

生殖毒性及其評定生殖毒性的評價

外源化學物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。生殖毒性試驗可以全面反映外源化學物對性腺功能、發(fā)情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。

生殖毒性及其評定評定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。是檢查外源化學物對動物生育繁殖機能有無損害作用的試驗。

生殖毒性及其評定生殖毒性的評價

試驗方法原則受試動物：性成熟大鼠、小鼠或家兔

劑量分組:一般設立三個劑量組（至少兩個劑量組）和一個對照組染毒途徑:動物接觸受試物的方法應參照人類實際接觸途徑動物數(shù):每組雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只

生殖毒性及其評定生殖毒性的評價

試驗方案

:三代兩窩

生殖毒性及其評定生殖毒性的評價

F３bF３aF１bF２bF２aF１aF０（斷奶或出生８周）

給予受試物８到１２周第一次交配第二次交配觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

斷乳后給予受試物８到１２周觀察三個月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況

斷乳后給予受試物８到１２周

兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗

生殖毒性及其評定F２斷奶，檢查發(fā)育情況F２出生，每窩留８只幼仔F１交配斷奶，給予受試物F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）第１６~１９周雌雄交配出生第８周給予受試物（F０）生殖毒性的評價

觀察指標：受孕率（％）:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況

正常分娩率（％）:反映雌性動物妊娠過程是否受到影響

幼仔出生存活率（％）:反映雌性動物分娩過程是否正常

幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力

除上述４個指標外，還應該注意出生幼仔是否有畸形存在，對死亡的幼仔應進行畸形檢查，可為下一步致畸試驗提供參考

生殖毒性及其評定生殖毒性的評價

一、動物發(fā)育毒性試驗

最佳聯(lián)合方案是對成年動物進行染毒并包括子代從受精卵到性成熟所有生長發(fā)育階段

觀察期應貫穿一個完整的生命周期，以檢測近、遠期效應

最常選用的方案為三階段試驗I階段試驗雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性著床期間染毒對成年雌雄性的生殖功能、配子的發(fā)生及成熟、交配行為、受精、著床前的發(fā)育和著床的影響Ⅱ階段試驗從著床到硬腭閉合期間染毒對成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、器官形成期的發(fā)育毒性Ⅲ階段試驗從著床到幼仔斷乳期間對孕（乳）母染毒從著床到子代性成熟的母體生殖毒性(妊娠、分娩和哺乳)和子代的發(fā)育毒性（胚胎、胎兒生長發(fā)育，新生幼仔宮外生活的適應性，斷乳前后的生長發(fā)育，獨立生活能力和性功能成熟）(一)大鼠全胚胎培養(yǎng)(wholeembryoculture,WEC)三、發(fā)育毒性的替代試驗

從孕期第9，10天大鼠子宮取出胚胎，剝去Reichert膜，放入培養(yǎng)液中加入受試物，在含O2、CO2、N2環(huán)境中，旋轉培養(yǎng)。觀察胚胎發(fā)育情況，記錄胚胎存活，檢測胚芽、卵黃囊直徑、體節(jié)和體長

以胚胎的心跳和血液循環(huán)是否存在作為胚胎存活的指標；以卵黃囊直徑、顱臀長和頭長、體節(jié)數(shù)和胚胎重作為胚胎生長發(fā)育的指標；根據(jù)Brown評分對器官形態(tài)分化作出評價。篩試化學物的發(fā)育毒性、探討其劑量反應關系和作用機制

(二)胚胎細胞微團培養(yǎng)

從第11天的大鼠胚胎取得代表CNS的原代中腦細胞微團、肢芽區(qū)或其他區(qū)的細胞微團，在培養(yǎng)瓶中分別加入不同濃度的受試物共同培養(yǎng)5天；用中性紅染色判斷細胞存活；用Alcian藍染色判斷肢芽軟骨細胞分化數(shù)量；蘇木素染色判斷CNS細胞分化數(shù)量。對結果進行處理，求出影響終點的IC50。比較受試物組與對照組數(shù)據(jù)，評價化學毒物的細胞毒性和發(fā)育毒性(micromassculture)（三）小鼠胚胎干細胞試驗

將小鼠胚泡內細胞團衍生的胚胎干細胞(embryonicstemcells，ES細胞)在特定條件下，可定向分化為機體多種細胞，因此可作為生物測試系統(tǒng)，用于哺乳動物細胞分化、組織形成過程的發(fā)育毒性研究

(themouseembryonicstemcelltest，EST)（四）體內預篩式樣（C.K.試驗）