肝素對炎癥的影響及其可能的作用機(jī)制,藥理學(xué)論文

肝素對炎癥的影響及其可能的作用機(jī)制,藥理學(xué)論文肝素發(fā)現(xiàn)于1916年，自1935年以來一直作為有效的抗凝血藥物應(yīng)用于臨床。肝素在臨床廣泛用于防治血栓栓塞性疾病、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的早期治療及體外抗凝。而研究顯示，肝素除具有抗凝作用外還具有多種生物活性，包括促進(jìn)胰蛋白脂酶及肝脂酶釋放、抑制補(bǔ)體活化、抑制血管生成和腫瘤生長，以及抗病毒活性。華而不實，肝素對炎癥經(jīng)過的影響正日益遭到關(guān)注。臨床研究顯示，給支氣管哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎、皮膚燒傷患者使用肝素能明顯減輕其炎癥反響;同樣，早期使用肝素干涉治療能改善脂多糖(LPS)導(dǎo)致的膿毒癥休克鼠的急性肺損傷，下調(diào)炎癥介質(zhì)，提高膿毒癥患者生存率。然而肝素并沒有作為一種抗炎藥物廣泛用于臨床，可能與其出血風(fēng)險高以及抗炎機(jī)制不明有關(guān)。作者將從肝素的構(gòu)造和功能出發(fā)，著重討論肝素對炎癥的影響及其可能的作用機(jī)制。1肝素的構(gòu)造肝素是一類由糖醛酸和D-葡糖胺二糖重復(fù)單位以1-4鍵連接構(gòu)成的線性多糖。二糖單位的N-硫酸基、O-硫酸基、N-乙?；榷喾N可變?nèi)〈鷺?gòu)成了多種復(fù)雜的序列。肝素由結(jié)締組織型肥大細(xì)胞表示出，以肝素蛋白聚糖的形式被生物合成(Mr750～1000kDa)肝素蛋白聚糖由一個獨(dú)特的核心蛋白(絲甘蛋白)和與其共價連接的多種肝素多糖鏈(Mr60～100kDa)組成。肝素構(gòu)造片段主要為IdoA2SGIcNS6S，如此圖1所示?！?】2肝素的抗炎作用及其機(jī)制2．1肝素結(jié)合蛋白當(dāng)前已被證實的肝素結(jié)合蛋白超過100種，并且其數(shù)量仍在不斷增長。這些蛋白可調(diào)節(jié)機(jī)體各項病理生理經(jīng)過，包括介入凝血和纖溶溶解、構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)、介入脂質(zhì)代謝以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，肝素同樣能夠結(jié)合急性時相反響蛋白和補(bǔ)體蛋白，這為肝素抗炎特性提供了一定的理論根據(jù)。大量研究資料證實，感染、創(chuàng)傷、休克等可激活單核-巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致各種炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生。肝素能夠結(jié)合炎性細(xì)胞釋放的特定酶和炎癥介質(zhì)如彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、嗜酸粒細(xì)胞過氧化物酶、嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白、主要堿性蛋白、細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而防止其與相應(yīng)受體結(jié)合，加速炎癥反響，引起白細(xì)胞活化、血管浸透性增加及組織損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，肝素霧化吸入可降低慢性阻塞性肺疾病大鼠血清中白細(xì)胞介素-8(IL-8)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平，使炎癥細(xì)胞減少，對大鼠氣道炎癥具有抑制作用。Hochart等也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后的人類單核細(xì)胞會產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，而當(dāng)用肝素預(yù)處理后，腫瘤壞死因子(TNF-)、IL-8、IL-6和白細(xì)胞介素-1(IL-1)這些細(xì)胞因子水平明顯下降。Handel等發(fā)現(xiàn)，肝素和趨化因子結(jié)合后，抑制趨化因子所介入或引發(fā)的炎性細(xì)胞黏附、滾動、趨化、游走及局部浸潤。肝素與堿性成纖維生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-(TGF-)互相作用，抑制其導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞增生及纖維組織修復(fù)，進(jìn)而延緩胃腸道腫瘤、冠狀動脈粥樣硬化、肝硬化等疾病的進(jìn)展。但是迄今為止，肝素結(jié)合域的構(gòu)造仍未知，且缺乏有效的檢測手段。然而一旦將其抗炎構(gòu)造提取出來進(jìn)行加工處理，將有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。2．2肝素和肥大細(xì)胞肝素能抑制免疫刺激或非免疫刺激誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞的活化?，F(xiàn)普遍以為其機(jī)制是:阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的1，4，5-三磷酸肌醇的受體，阻止內(nèi)源性鈣離子的釋放，進(jìn)而抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及組胺的釋放。通過這一機(jī)制，肝素同樣可能阻止其他類型細(xì)胞脫顆粒。例如，肝素與嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合能夠抑制其脫顆粒，抑制超氧化物陰離子產(chǎn)生及溶酶體的活化，抑制嗜中性粒細(xì)胞激活血小板的能力。2．3肝素和選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附在炎癥反響經(jīng)過中，大量活化的白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，進(jìn)而引起白細(xì)胞游走出血管，釋放大量蛋白酶和超氧離子，毀壞組織細(xì)胞膜和細(xì)胞器的通透性與完好性，使溶酶體膜破裂，損傷組織細(xì)胞，最終引起組織器官構(gòu)造損傷和功能障礙。大量研究證據(jù)表示清楚，肝素能抑制白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮。Lever等發(fā)現(xiàn):在小鼠腹膜炎模型中，當(dāng)給予肝素后，腹腔灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞計數(shù)均明顯低于對照組;同樣，將LPS激活的外周血單核細(xì)胞與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和E選擇素等內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表示出上調(diào)，而肝素能明顯抑制上述現(xiàn)象。選擇素是血管黏附分子大家族中的一大類成員，根據(jù)表示出部位可分為3類:E-選擇素表示出于活化的內(nèi)皮細(xì)胞外表;L-選擇素表示出于白細(xì)胞外表;P-選擇素則表示出于活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞外表。在感染及其他炎性反響經(jīng)過中，選擇素通過與相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁接觸，并使白細(xì)胞在血管壁上緩慢滾動，最終導(dǎo)致白細(xì)胞在炎性反響區(qū)域集中。選擇素中的凝集素樣構(gòu)造決定其配體是糖類，包括SLex和其異構(gòu)體SLea。而肝素和相關(guān)的葡萄糖胺多糖能與這些凝集素樣分子結(jié)合，干擾自然配體的作用，進(jìn)而抑制嗜中性粒細(xì)胞與活化的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。2整合素(CD11/CD18復(fù)合物)是整合素家族分子成員之一，表示出于嗜中性粒細(xì)胞外表，在介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的嚴(yán)密黏附中發(fā)揮重要作用。整合素家族分子是由、兩個亞單位通過非共價連接而組成的異源二聚體。血小板活化因子、C5a和IL-8等炎癥介質(zhì)刺激能使CD11/CD18復(fù)合物從一個低親和力構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力構(gòu)象狀態(tài)，進(jìn)而其在細(xì)胞膜外表表示出增加。2整合素的配體是ICAM-1，它在內(nèi)皮細(xì)胞上持續(xù)表示出，在遭到TNF-、IL-1、TNF-和內(nèi)毒素等炎癥介質(zhì)的刺激后表示出上調(diào)，進(jìn)而與活化的2整合素結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞移行。Diamond等發(fā)現(xiàn)，肝素能與Mac-1(CD11b/CD18)互相作用，調(diào)節(jié)白細(xì)胞的黏附;進(jìn)一步研究表示清楚，肝素可與纖維蛋白原、凝血因子X和iC3競爭性結(jié)合Mac-1;低分子肝素同樣能抑制纖維蛋白原與Mac-1的結(jié)合。大量研究資料揭示肝素與Mac-1的結(jié)合在抗凝、抑制炎癥反響及細(xì)胞增生經(jīng)過中發(fā)揮重要作用。2．4肝素和核因子-B(NF-B)NF-B是一種重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞炎性反響、免疫反響以及細(xì)胞凋亡等經(jīng)過中起著舉足輕重的作用。研究發(fā)現(xiàn)，活性形式的NF-B只存在于核抽提物中，胞質(zhì)中的NF-B與一種抑制蛋白inhibitoryB(IB)結(jié)合，以無活性狀態(tài)穩(wěn)定地存在于胞質(zhì)中。很多免疫刺激因子如細(xì)胞因子、生長因子、絲裂原、脂多糖和某些病毒蛋白等作用于細(xì)胞后，NF-B活化，迅速發(fā)生核易位，與特異性B序列結(jié)合而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。迄今為止，已證實的NF-B靶基因包括促炎癥細(xì)胞因子如TNF-、IL-6等，細(xì)胞黏附分子如VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素等，趨化因子如單核細(xì)胞趨化因子、IL-8等，生長因子如血小板源性生長因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。這些因子對細(xì)胞的活化、增殖、浸潤、趨化和分泌功能起著直接的調(diào)控作用。Zhao等發(fā)現(xiàn)，肝素能抑制細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAKP)的磷酸化表示出及NF-B的活化，下調(diào)TNF-、IL-6、IL-1等炎癥介質(zhì)的水平，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠急性肺損傷。同樣，離體實驗也表示清楚，肝素通過抑制NF-B的活化，減輕LPS刺激后人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反響，下調(diào)E-選擇素、ICAM-1等水平。揣測肝素可能通過結(jié)合帶正電的NF-B核定位信號序列，阻止核易位，進(jìn)而抑制其活化引起的各種促炎基因的高度轉(zhuǎn)錄，減少炎癥介質(zhì)生成，減輕機(jī)體的組織損傷和器官功能紊亂。2．5肝素和細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定條件下接受刺激信號并受基因調(diào)控的一種自主性、程序性死亡經(jīng)過。凋亡途徑包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑等。這幾種途徑都能夠激活細(xì)胞凋亡蛋白酶家族成員，最終導(dǎo)致細(xì)胞降解死亡。腫瘤壞死因子受體(TNFRs)是具有代表性的最大死亡受體家族，主要包括TNFRⅠ(p55，CD120a)、TNFRⅡ(p75，CD120b)等。其共同特點(diǎn)是:具有富含2～5個半胱氨酸的細(xì)胞外重復(fù)序列和細(xì)胞內(nèi)死亡區(qū)域(DD)，DD是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號所必須的，其對應(yīng)物稱為死亡配體。配體TNF-與TNFRs結(jié)合后，TNFRⅠ三聚體化，并激活TNFRⅠ在質(zhì)膜外表局部招募Fas相關(guān)死亡構(gòu)造域蛋白(FADD)、TNFRⅠ相關(guān)死亡域結(jié)合蛋白(TRADD)，進(jìn)而招募、水解活化半胱天冬蛋白酶-8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。半胱天冬蛋白酶在凋亡經(jīng)過中起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的經(jīng)過實際上是半胱天冬蛋白酶不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反響經(jīng)過。Pettigrew等將TNF-轉(zhuǎn)基因大鼠和正常大鼠做成腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)TNF-轉(zhuǎn)基因大鼠表示出大量TNF-，明顯加重了腦損傷。而TNF-敲除可顯著降低小鼠急性心肌梗死死亡率，其機(jī)制與減少炎癥細(xì)胞浸潤、炎性細(xì)胞因子表示出有關(guān)，也和抑制TNFRⅠ介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)有關(guān)。然而有研究表示清楚，在小鼠心肌缺血模型中，肝素能夠降低TNF-基因的表示出與上調(diào)。再者上文也提到肝素能抑制P-選擇素和整合素介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的募集，而活化的嗜中性粒細(xì)胞是TNF-的主要來源。由此得出，肝素可能通過降低TNF-水平，進(jìn)而抑制TNFRⅠ介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)。細(xì)胞凋亡的另一種途徑為線粒體途徑。任何引起線粒體膜電位改變和影響氧化磷酸化經(jīng)過的因素均將導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放，釋放到胞漿的細(xì)胞色素C在脫氧腺苷三磷酸(dATP)存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，使其構(gòu)成多聚體，并促使半胱天冬蛋白酶-9與其結(jié)合構(gòu)成凋亡小體，半胱天冬蛋白酶-9被激活，進(jìn)而激活其他半胱天冬蛋白酶，如半胱天冬蛋白酶-3等，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C為一堿性蛋白，其前體從胞漿透過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，并與線粒體膜間隙的血紅素結(jié)合為成熟的細(xì)胞色素C并帶上正電。而Apaf-1分子構(gòu)造中存在帶負(fù)電的色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列，因而當(dāng)帶正電的細(xì)胞色素C與Apaf-1負(fù)電區(qū)結(jié)合，即能激半胱天冬蛋白酶-9。作為一個強(qiáng)大的聚陰離子，肝素能與Apaf-1競爭性結(jié)合帶正電的細(xì)胞色素C，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。有研究顯示，在肝素存在情況下，細(xì)胞色素C與抗壞血酸的反響效率下降200倍，講明在氧化復(fù)原反響中，肝素能夠大大降低細(xì)胞色素C的活性。3無抗凝活性肝素抗炎研究的現(xiàn)在狀況與瞻望肝素可用于治療炎癥，但很強(qiáng)的抗凝血活性從根本上限制了其抗炎癥的臨床應(yīng)用前景。為此，研制出了多種化學(xué)修飾肝素衍生物，如高碘酸鹽氧化、N-位脫硫酸根、N-位脫硫酸根再乙酰化、N-位非替代肝素類似物的修飾、2-O和6-O位脫硫酸根等。這些修飾肝素具有相對較低的抗凝血活性，并保存了一定的抗炎癥功能。近期研究表示清楚，肝素的抗炎活性不依靠其抗凝血活性。Collino等研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，N-位及O-位脫硫酸肝素的應(yīng)用能明顯抑制缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肥大細(xì)胞脫顆粒，抑制脂質(zhì)過氧化物聚集及氧自由基的釋放，抑制鈣離子超載，下調(diào)炎癥介質(zhì)水平。另有報道指出肝素鏈上葡萄糖胺6-O-位的硫酸是肝素具有抗炎活性的關(guān)鍵基團(tuán)。因而，通過采用不同的化學(xué)修飾方式方法，尋找最佳無抗凝活性肝素，是當(dāng)下肝素抗炎癥研究的重點(diǎn);另外，針對炎癥反響經(jīng)過中的不同靶分子，尋找肝素鏈上與之特異性結(jié)合的寡糖片段的構(gòu)造信息，也將是研究重點(diǎn)之一。肝素作為抗凝劑應(yīng)用于臨床已將近80年，其副作用已經(jīng)很清楚，如內(nèi)出血、血小板減少癥及骨質(zhì)增生。因而，無抗凝活性肝素將是安全的、潛