特異性引物GSP對(duì)玉米絲黑穗病苗的檢測(cè)效率,植物保護(hù)論文

特異性引物GSP對(duì)玉米絲黑穗病苗的檢測(cè)效率,植物保護(hù)論文玉米作為中國(guó)乃至全世界第一大糧食作物,是重要的糧食作物和飼料來(lái)源,同時(shí)也是全球總產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)糧食作物.而玉米絲黑穗病作為一種全球性的病害已經(jīng)嚴(yán)重的影響了全球各地玉米的產(chǎn)量,同時(shí)也是制約我們國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要病害之一.玉米絲黑穗病又名烏米、啞玉米等,在華中、華北、華南、東北、西北和西南地區(qū)都普遍發(fā)生.2002年?yáng)|北地區(qū)玉米絲黑穗病大面積的發(fā)生,其平均發(fā)病率為10%~15%,嚴(yán)重的地區(qū)高70%~80%.隨著玉米感病品種的大規(guī)模種植,玉米絲黑穗病的發(fā)病率一年高過(guò)一年,并且已經(jīng)成為了危害我們國(guó)家玉米產(chǎn)量的重要病害.因而,尋找一種能夠快速且有效的方式方法對(duì)玉米絲黑穗病進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為重要,為研究絲孢堆黑粉菌的致病機(jī)理,尋找防治該病害的新途徑、新方式方法提供技術(shù)支持.在對(duì)植物進(jìn)行某種病原檢測(cè)中,通常使用的是PCR檢測(cè)技術(shù).PCR技術(shù)用來(lái)檢測(cè)病原物是指選擇某一特定的引物去擴(kuò)增相應(yīng)的目的DNA片段.該實(shí)驗(yàn)所采用的引物是由上海生工生物公司合成的玉米絲黑穗病菌的特異性引物(GSP),然后采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)τ衩撞∶缰械慕z黑穗病菌基因組進(jìn)行特異性的擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增的樣品DNA進(jìn)行濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和記錄,進(jìn)而得知玉米能否感染了絲黑穗病.最后計(jì)算出該特異性引物GSP對(duì)玉米病苗的檢測(cè)效率,看能否能夠用于快速有效的對(duì)玉米感病植株在發(fā)病之前對(duì)病菌進(jìn)行檢測(cè).1材料與方式方法1.1材料準(zhǔn)備(1)絲黑穗冬孢子的觀察稱取10mg已經(jīng)處理好的玉米絲黑穗病菌冬孢子粉,將其置于1.5mL的離心管中,參加適量的無(wú)菌水浸泡過(guò)夜,然后置于高速離心機(jī)中離心2min(10000r/min),棄掉上清液.再用無(wú)菌水處理1d,再次離心并棄掉上清液.將已經(jīng)處理好的冬孢子沉淀浸泡于配置好的2%葡萄糖溶液中,置于28℃的溫箱中黑暗培養(yǎng)3d,3d后觀察冬孢子的萌發(fā)狀態(tài).(2)試驗(yàn)材料及病菌玉米感病品種(黃早4),植物DNA提取試劑盒(寶生物公司購(gòu)買(mǎi)),供試絲黑穗病菌(將事先收集好的病菌樣品置于室內(nèi)晾干,再用篩子充分挑選出孢子粉,將孢子粉置于通風(fēng)、陰涼、枯燥處保存?zhèn)溆?.(3)配置菌土土壤采樣后放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌,待土壤冷卻后參加玉米絲黑穗菌粉配置成1%的菌土.(4)播種與接種選取200粒感病品種黃早4,將種子在4月20日播種于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所屬的玉米試驗(yàn)田(公主嶺),每穴2~3粒,將配置好的菌土覆蓋在玉米種子上.(5)取樣在玉米抽穗前期(此時(shí)病狀并未表現(xiàn)出來(lái))對(duì)玉米的根與葉片組織進(jìn)行采樣.1.2試驗(yàn)方式方法1.2.1DNA的提取方式方法(采用試劑盒提取,提取方式方法參照講明書(shū))將采集的每份玉米根與葉片的樣品取適量置于研缽中用液氮充分的研磨,將研磨好的樣品組織(不多于50mg)分裝于1.5mL的離心管中,并分別做好標(biāo)記.參加400LLEBuffer,上下顛倒混合均勻,迅速置于65℃環(huán)境中溫浴15~30min(期間可震蕩離心管2-3次),然后移出.然后向離心管中參加130LDABuffer,充分混勻,在冰盒中放置5min,再放入Sigma微量臺(tái)式離心機(jī)中14000r離心3min,待離心完成后用移液器汲取上層清液,將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)已滅菌的1.5mL離心管中.參加750L的EBindingBuffer(使用前已按講明參加了28mL的無(wú)水乙醇),上下顛倒混勻后將混合液轉(zhuǎn)移至Spincol-um中,在高速離心機(jī)中6000r離心1min,并倒掉接液管中的液體,由于此時(shí)的混合液體積大于750L,所以需要分2次進(jìn)行離心過(guò)柱.之后向Spincolum中參加500L的GBindingBuffer,于10000r離心30s,并倒掉接液管中的液體.在Spincolum中參加600L的WashBuffer(使用前已按講明參加了37.8mL的無(wú)水乙醇).于10000r離心30s,倒掉接液管中的液體,再重復(fù)此步驟一次.然后將Spincolum轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mL的離心管中,向華而不實(shí)參加100L的ElutionBuff-er,放于室溫溫浴1min后,最后于離心機(jī)中12000r離心1min,并棄掉Spincolum,此1.5mL的離心管中的液體含有所需DNA,置于-20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?1.2.2DNA純度的檢測(cè)隨機(jī)抽取已提取的樣品DNA進(jìn)行電泳檢測(cè),每個(gè)隨機(jī)樣品取5L于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,電流180mA,電壓180V,電泳15min,于凝膠成像系統(tǒng)中觀察DNA的降解情況及能否有RNA的影響.PCR檢測(cè):(1)所使用的引物購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物公司,引物GSP的序列為上游5-TCGCCGACGGATGATAATCG-3下游5-GAGTCACCCGCCCAAAGTTA-3(2)反響程序:共設(shè)置35個(gè)循環(huán),步驟如下:94℃(預(yù)變性)4min94℃(變性)1min54℃(復(fù)性)1min72℃(延伸)1.5min72℃(延伸)5min4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?3)1.5%瓊脂糖凝膠電泳用萬(wàn)分之一天平稱取適量的瓊脂糖,參加適量的已配置好的TAE溶液配制成1.5%凝膠,用微波爐將其沸騰一次后參加適量的EB,趁熱倒入插好梳子的制膠槽中,待凝膠凝固后參加PCR的產(chǎn)物,10L的樣品,并參加DNAMarker.(4)電泳的結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和記錄.2、結(jié)果與分析2.1玉米絲黑穗冬孢子萌發(fā)情況的觀察從溫箱中取出已培養(yǎng)3d的玉米絲黑穗冬孢子,汲取適量的冬孢子滴于載玻片的,并滴幾滴無(wú)菌水后蓋上蓋玻片,至于電子顯微鏡下觀察其萌發(fā)狀態(tài).結(jié)果如下.冬孢子萌發(fā)前的狀態(tài),在將其至于2%的葡萄糖溶液中,28℃黑暗培養(yǎng)3d后,其萌發(fā)狀態(tài).講明該絲黑穗冬孢子粉具有活性且能正常萌發(fā),能夠使用其對(duì)玉米進(jìn)行侵染.2.2DNA的提取與檢測(cè)將采用試劑盒方式方法提取的DNA樣品,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果表示清楚,用試劑盒所提取的樣本組織的DNA能夠獲得高質(zhì)量的DNA,能夠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn).2.3PCR結(jié)果檢測(cè)2.3.1玉米葉片組織中絲黑穗病原菌的檢測(cè)為帶病玉米植株葉片組織DNA的電泳結(jié)果,華而不實(shí)M是DNAMarker,1~10,13~22均為黃早4未發(fā)病葉片組織DNA,11、23均為水(CK),12、24均為玉米絲黑穗病菌的DNA.根據(jù)圖4可知,以玉米葉片DNA為模板進(jìn)行病菌PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只擴(kuò)增出了3條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶,華而不實(shí)5號(hào)較為明顯,14號(hào)、21號(hào)均不明顯,病菌的檢測(cè)效率僅為15%.2.3.2以玉米根組織中絲黑穗病原菌的檢測(cè)為帶病玉米植株根組織DNA的電泳結(jié)果,華而不實(shí)M是DNAMarker,1~10,13~22均為黃早4未發(fā)病根組織DNA,11、23為水(對(duì)照),12、24為玉米絲黑穗病菌的DNA.以玉米葉片DNA為模板進(jìn)行病菌PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出了16條與玉米絲黑穗病菌在同一范圍內(nèi)的譜帶,僅有2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)沒(méi)有擴(kuò)增出譜帶,13號(hào)不太明顯,病菌的檢測(cè)效率為80%.3結(jié)論與討論通過(guò)選用玉米感病品種黃早4抽穗前期的葉片和根組織的DNA進(jìn)行提取,然后采用玉米絲黑穗病菌的特異性引物(GSP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn)以葉片的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí),其檢測(cè)效率僅僅為15%并不能對(duì)病苗能否帶有玉米絲黑穗病菌進(jìn)行有效的檢測(cè).而以根組織的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)效率為80%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片DNA的檢測(cè)效率.因而能夠快速有效的對(duì)玉米幼苗在發(fā)病前期檢測(cè)出植株能否感染了玉米絲黑穗病.在PCR擴(kuò)增的反響程序中將退火溫度設(shè)置為54℃(根據(jù)引物GSP的特性設(shè)置了3個(gè)退火溫度梯度,分別是53℃、54℃、55℃,其余條件均不變的情況下發(fā)現(xiàn),當(dāng)退火溫度為54℃時(shí)凝膠電泳檢測(cè)圖譜最為清楚明晰),35個(gè)循環(huán)時(shí),以玉米絲黑穗病菌的特異性引物GSP對(duì)玉米絲黑穗病病苗中的病菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其病菌的檢測(cè)率到達(dá)80%,因而能夠用于快速且有效的在玉米絲黑穗病的發(fā)病前期對(duì)絲黑穗病菌進(jìn)行檢測(cè),提早進(jìn)行防治,降低玉米絲黑穗病對(duì)玉米產(chǎn)量的影響.在對(duì)玉米絲黑穗病進(jìn)行PCR研究時(shí),通常提取的是玉米下部組織的DNA而不采用玉米葉片組織的DNA.通過(guò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),玉米絲黑穗病屬于幼苗期侵染的一種系統(tǒng)性的病害,絲黑穗的病原菌以散落在土壤中、混入到糞肥中或附著在玉米種子外表的冬孢子越冬,第二年成為主要的傳染源,華而不實(shí)以土壤帶菌侵染為主.病原菌于種子萌發(fā)開(kāi)場(chǎng)從根莖、胚芽以及芽鞘侵染,并且在植株體內(nèi)構(gòu)成菌絲,跟隨著植物向上生長(zhǎng).因而,在玉米植株的下部組織DNA中的病原菌濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上部組織DNA中的病原菌濃度,而葉片中的病原菌數(shù)量要低于莖髓組織和根部組織甚至是沒(méi)有(如此圖4所示),由于病原菌菌絲是選擇性的對(duì)植株的部位進(jìn)行侵染的,若選擇侵染葉片則不利于病原菌的繁衍.玉米絲黑穗是一種比擬復(fù)雜的病害,當(dāng)前對(duì)它的發(fā)病機(jī)制了解還不是很透徹,而針對(duì)玉米品種的抗性而言,當(dāng)前尚無(wú)絕對(duì)的免疫品種,抗病與不抗病是相對(duì)的概念,只要做到早檢測(cè)、早發(fā)現(xiàn)、早防治才能將玉米絲黑穗病的危害降到最低,才能保證玉米的產(chǎn)量.隨著當(dāng)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,有關(guān)玉米分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)的研究領(lǐng)域也在不斷向更深層面發(fā)展,隨著人們對(duì)玉米絲黑穗病的探尋求索和研究越來(lái)越深切進(jìn)入,將會(huì)有助于推進(jìn)玉米抗絲黑穗病育種獲得新的研究進(jìn)展.以下為參考文獻(xiàn):[1]李玥瑩,董雪卉,許麗,等.玉米抗絲黑穗病基因RAPD分析[J].生物技術(shù),2006(5):16-18.[2]邢躍先,吳鳳新,蔡鑫茹,等.葉片DNA對(duì)玉米絲黑穗病研究的可靠性[J].玉米科學(xué),2008(6):114-116.[3]晉齊名.東北地區(qū)玉米、大豆重要病蟲(chóng)害辨別與防治.吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2018.[4]白壽發(fā),高增貴,張小飛.玉米絲黑穗病菌PCR檢測(cè)[J].雜糧作物,2018(4