實(shí)驗一特殊顯微鏡的使用

特殊生物顯微鏡的原理與使用盛軍慶南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院主要內(nèi)容暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡1暗視野顯微鏡根據(jù)丁達(dá)爾效應(yīng)原理設(shè)計的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡觀察到明場看不到的極其微小的物體最高分辨率可達(dá)0.004微米1.1原理丁達(dá)爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來，灰塵便粒粒可見了，這就是微粒發(fā)光。暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計的。1.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個視野是黑暗的。暗場顯微鏡原理1.3成像特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時，并大于1／2波長，則各級衍射光線同時進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動等。1.4應(yīng)用：微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等。1.5暗場顯微鏡的要求要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵物鏡前透鏡必須清潔無塵載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求1.6暗場觀察方式調(diào)節(jié)(1)換上暗場聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當(dāng)縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個調(diào)節(jié)螺絲進(jìn)行調(diào)整，再將其開大到相應(yīng)位置。二、熒光顯微鏡一、原理熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。

什么是熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光熒光的種類：自發(fā)熒光（固有熒光）二次熒光熒光的性質(zhì)：吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率二、熒光顯微鏡的種類：透射式落射式三、熒光顯微鏡主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造落射熒光顯微鏡光路圖透射熒光顯微鏡光路圖

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。四、使用方法．1．打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；4．高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。五、用途1觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)2標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。3細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測定。4熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測該抗原的存在與分布。三、試劑與器材魚、草履蟲、甲醇、5‰丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡四、實(shí)驗內(nèi)容和實(shí)驗步驟魚血細(xì)胞染色觀察：取少許魚血→常規(guī)血涂片→涼干→甲醇固定10min→5‰

丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥（濾紙擦干玻片底面）→熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞）取洋蔥→撕取一小片內(nèi)表皮→平面單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室溫干燥（或用濾紙擦干）→熒光顯微鏡觀察3相差顯微鏡3.1原理光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。3.2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸調(diào)節(jié)用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。3.3使用方法（1）相差裝置的調(diào)換安裝卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍(lán)色光，使波長范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。

（2）調(diào)焦打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0”對準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40X時應(yīng)用40X標(biāo)示孔的光闌。（3）合鈾調(diào)整拔出目鏡，插入合軸望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其上升，當(dāng)對準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕