細(xì)胞培養(yǎng)工程 01 緒論

細(xì)胞培養(yǎng)工程沈炳謙12課程安排以蛋白質(zhì)藥物基因表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)過程為主線：課堂教學(xué)考慮安排實(shí)驗(yàn)操作訓(xùn)練教材：中文教材更新慢，以課件為主，參考書自選一本。考試成績(jī)：考勤：10%考試方式（二選一，同學(xué)表決）：90%開卷考試（以課件內(nèi)容為主）自選相關(guān)題目演講3教學(xué)計(jì)劃1緒論細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理42細(xì)胞培養(yǎng)基43細(xì)胞培養(yǎng)理論44生物反應(yīng)器-傳動(dòng)現(xiàn)象45生物反應(yīng)器-傳質(zhì)現(xiàn)象46細(xì)胞培養(yǎng)模式與調(diào)控47生物反應(yīng)器控制理論48發(fā)酵工程（或蛋白質(zhì)純化）

考試4細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程張?jiān)d等2007參考書動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南(第5版)

BioprocessEngineeringPrinciplesPaulineM.Doran1995BasicBioreactorDesignvan'tRiet&Tramper1991CellCultureBioprocessEngineeringWei-ShouHu2012細(xì)胞培養(yǎng)工程元英進(jìn)20125/china-mainland/zh/life-science/cell-culture/learning-center/cell-culture-manual.html緒論6根據(jù)中華人民共和國藥典，藥品分三類中藥化學(xué)藥生物制藥（目前主要是蛋白質(zhì)藥物、疫苗等）美國FDA將藥品也分三類為小分子藥物（化學(xué)藥）大分子藥物（蛋白質(zhì)藥物、疫苗等）細(xì)胞藥物（干細(xì)胞、組織工程、免疫治療等）2.&3.皆為生物藥78后現(xiàn)代藥學(xué)發(fā)展理念生命科學(xué)的快速發(fā)展，推動(dòng)了以化學(xué)為主體的傳統(tǒng)藥學(xué)研究模式向以生命科學(xué)與化學(xué)相結(jié)合的新模式轉(zhuǎn)變；以分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)為代表的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)研究與生物技術(shù)實(shí)踐雖然只有短短幾十年，對(duì)新藥（包括大分子藥物和細(xì)胞）的發(fā)現(xiàn)、研究、生產(chǎn)、質(zhì)量管理和藥品臨床應(yīng)用等方面均產(chǎn)生了重要影響；以現(xiàn)代生物技術(shù)手段生產(chǎn)的蛋白質(zhì)多肽類藥物在臨床上的成功應(yīng)用，使醫(yī)藥生物技術(shù)成為生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展最快、效益最高、最有發(fā)展前景的應(yīng)用領(lǐng)域；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程是銜接現(xiàn)代生物學(xué)理論、新發(fā)現(xiàn)與化學(xué)工程原理，并應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)藥物研發(fā)、生產(chǎn)和新型細(xì)胞治療技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要技術(shù)手段。8動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)9在體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的專門技術(shù)，即在無菌條件下，（1）從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞（原代細(xì)胞），或（2）利用已經(jīng)建立的動(dòng)物細(xì)胞系（細(xì)胞株），在模擬機(jī)體內(nèi)生理狀態(tài)的基本環(huán)境條件下，讓細(xì)胞在培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或生物反應(yīng)器）中生存、生長(zhǎng)和繁殖的方法；基礎(chǔ)研究：細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物學(xué)研究中廣泛使用、不可或

缺的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；生物產(chǎn)業(yè)：大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。1010細(xì)胞培養(yǎng)：基礎(chǔ)研究應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)：基礎(chǔ)研究應(yīng)用簡(jiǎn)化環(huán)境條件，排除體內(nèi)實(shí)驗(yàn)復(fù)雜影響因素，便于應(yīng)用生物、物理、化學(xué)等外界因素，探索和揭示細(xì)胞生命活動(dòng)的基本規(guī)律；便于應(yīng)用各種技術(shù)和方法，研究和觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的變化；通常采用小型培養(yǎng)容器（如培養(yǎng)皿，96孔板等），培養(yǎng)基一般含有動(dòng)物血清（如小牛血清，5-20%），細(xì)胞貼壁，靜止培養(yǎng)。11細(xì)胞培養(yǎng)：醫(yī)藥研發(fā)應(yīng)用現(xiàn)代新型藥物開發(fā)必須依循生物學(xué)原理（生理作用機(jī)制），并盡可能利用（1）相關(guān)藥物作用靶點(diǎn)（生物大分子，目前主要是蛋白質(zhì)如鴉片受體）或（2）載有靶點(diǎn)的工具細(xì)胞為評(píng)估對(duì)象，減少藥物發(fā)現(xiàn)的盲目性，提高藥物設(shè)計(jì)與篩選效率；藥物作用的細(xì)胞模型（具有商業(yè)價(jià)值）減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用使藥物篩選微型化、高通量化、自動(dòng)化，使信息采集效率大幅提高12細(xì)胞培養(yǎng)工程13細(xì)胞培養(yǎng)工程是以動(dòng)物細(xì)胞為對(duì)象，研究在體外培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的關(guān)系（動(dòng)力學(xué)），并利用化學(xué)工程原理指導(dǎo)優(yōu)化生物反應(yīng)器的攪拌、通氧、反應(yīng)器操作模式以及培養(yǎng)環(huán)境控制，關(guān)乎產(chǎn)物質(zhì)量（大分子藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)比小分子復(fù)雜）、生產(chǎn)效率、生產(chǎn)成本；細(xì)胞培養(yǎng)工程是應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從事生產(chǎn)過程工藝開發(fā)和過程放大的重要工程理論。大規(guī)模生產(chǎn)過程（上千升或更大）將細(xì)胞至于完全不同的生長(zhǎng)環(huán)境，細(xì)胞在可控的生長(zhǎng)環(huán)境中（生物反應(yīng)器）經(jīng)歷機(jī)械攪拌、通氧并對(duì)環(huán)境做出生理調(diào)整。如何控制細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境以滿足細(xì)胞生理需求、達(dá)到最高生產(chǎn)效率，需要化學(xué)工程原理與細(xì)胞生理的緊密結(jié)合。1414大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前生物制品商業(yè)化生產(chǎn)的最重要工業(yè)技術(shù)，使眾多疾病得到前所未有的治療蛋白藥物：抗體，血液蛋白，細(xì)胞因子，疫苗病毒：疫苗，基因治療載體細(xì)胞治療與再生醫(yī)學(xué)等新興治療直接受益干細(xì)胞與組織工程原代細(xì)胞體外擴(kuò)增與分化組織工程部件體外構(gòu)建細(xì)胞治療：免疫治療等大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)組織與細(xì)胞培養(yǎng)病毒疫苗細(xì)胞天然分泌物有血清貼壁培養(yǎng)生化制藥臟器藥物提取胰島素，白蛋白等深層發(fā)酵技術(shù)（攪拌，通氧）WWII，開啟抗生素、氨基酸、維生素、酶等新工業(yè)重組人蛋白質(zhì)表達(dá)（E.coli）胰島素，生長(zhǎng)激素，G-CSF，-干擾素，淋巴介素-2高分子量基因可能有問題缺乏翻譯后修飾，尤其是二硫鍵連接與糖基化微生物發(fā)酵厭氧發(fā)酵技術(shù)WWI，有機(jī)溶劑（炸藥干燥）多種反應(yīng)器設(shè)計(jì)無血清培養(yǎng)基研發(fā)無血清懸浮培養(yǎng)重病毒疫苗組人蛋白質(zhì)表達(dá)翻譯后修飾大規(guī)模無血清懸浮重組人蛋白質(zhì)表達(dá)病毒疫苗改進(jìn)攪拌式反應(yīng)器設(shè)計(jì)解決細(xì)胞損傷無細(xì)胞（Cellfree）蛋白質(zhì)表達(dá)E.coli胞漿加入伴侶蛋白可以二硫鍵連接生物制藥歷史回顧生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史疫苗生化制藥（臟器藥物）16生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：傳統(tǒng)生物技術(shù)

人類傳統(tǒng)釀造技術(shù)有數(shù)千年歷史，但直到顯微鏡的發(fā)明，人類才獲知微生物的存在，并進(jìn)一步獲知“酵素”（酶）的存在；工業(yè)微生物：19世紀(jì)末到20世紀(jì)30年代，微生物發(fā)酵生產(chǎn)初級(jí)代謝產(chǎn)品，如乳酸、乙醇、丙醇、丁醇、檸檬酸（WWI用于炸藥干燥）及淀粉酶（蛋白質(zhì)）等。17生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)青霉素1928年Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素，放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物；1939年Florey&Chain：提取純化、臨床試驗(yàn)；1941年，英美聯(lián)合開發(fā)青霉素生產(chǎn)工藝，用于WWII傷員感染治療1943年，生產(chǎn)1公斤20%含量青霉素表面培養(yǎng)法80,000個(gè)1L搖瓶勞動(dòng)力消耗巨大（清洗、裝料、滅菌、接種、培養(yǎng)、出料等操作）18生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)

青霉素生產(chǎn)工藝的技術(shù)革命：深層發(fā)酵技術(shù)：5,000L，攪拌式發(fā)酵罐；放線菌菌種誘變、選育；發(fā)酵（培養(yǎng)）過程優(yōu)化；提煉技術(shù)及其設(shè)備等方面；產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量都大幅度提高，生產(chǎn)效率明顯提高，成本顯著下降；促進(jìn)發(fā)酵工程技術(shù)成為近代生物制藥工業(yè)的基礎(chǔ)技術(shù)。19生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)深層發(fā)酵技術(shù)的廣泛應(yīng)用抗生素工業(yè)：鏈霉素、金霉素、紅霉素等氨基酸發(fā)酵工業(yè)：上世紀(jì)五十年代酶制劑工業(yè)環(huán)境保護(hù)技術(shù)主要產(chǎn)品醫(yī)藥藥品：抗生素、維生素、甾體激素、氨基酸等；食品工業(yè)：酶制劑、氨基酸、酵母、啤酒等；化學(xué)工業(yè)：醇類、有機(jī)酸、農(nóng)藥等。20生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)生物分離（下游過程）技術(shù)與設(shè)備離子交換技術(shù)凝膠色譜技術(shù)膜分離技術(shù)親和色譜技術(shù)1952年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（分溶層析法）21ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSynge生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)疫苗工業(yè)1796年：牛痘疫苗1930年代：小鼠腦組織或雞胚培養(yǎng)繁殖病毒方法黃熱病、流腦、乙腦、森林腦炎和斑疹傷寒疫苗1950年代：離體細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖病毒的技術(shù)；小兒麻痹癥、麻疹、腮腺炎等新疫苗。2223骨髓灰質(zhì)炎疫苗

骨髓灰質(zhì)炎病毒陽性mRNA病毒7,500核甘酸，編碼唯一（殼）蛋白質(zhì)直徑30納米結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單病毒骨髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）病毒從口腔進(jìn)入，感染腸道黏膜上皮細(xì)胞并繁殖，經(jīng)血液進(jìn)入大腦或脊髓感染源為病患糞便和口鼻分泌物兒童較成年人更易感，導(dǎo)致終生殘廢2424骨髓灰質(zhì)炎病毒體外繁殖1948年3月，Weller在設(shè)法用人胚胎肺細(xì)胞培養(yǎng)制備水痘病毒的實(shí)驗(yàn)中，將多余的幾個(gè)試管接種了骨髓灰質(zhì)炎病毒；前者失敗，后者為體外制備病毒成功先例；54年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)EndersWellerRobbinsJonasSalk（1914

–1995）骨髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（Salkvaccine）1952年Verocellline（猴腎）培養(yǎng)接種骨髓灰質(zhì)炎病毒福爾馬林滅活1955年正式投入預(yù)防使用骨髓灰質(zhì)炎疫苗

主要人類病毒疫苗25DiseaseSourceofvaccineViralconditionPoliomyelitisTC(humandiploidcellline,monkeykidneyLiveattenuated,inactivatedMeaslesTC(chickenembryo)LiveattenuatedMumpsTC(chickenembryo)LiveattenuatedRubellaTC(duckembryo,rabbitorhumandiploid)LiveattenuatedSmallpox(vaccinia)Lymphfromcalforsheep(glycerolated,lyophilized)LivevacciniaSmallpox(vaccinia)Chorioallantois,TC(lyophilized)VacciniaYellowfeverTCandeggs(17Dstrain)LiveattenuatedInfluenzaHighlypurifiedsubunitformsofchickenembryoallantoicfluid(formalinizedUVirradiated)InactivatedInfluenzaCC(MDCK,Vero)AttenuatedRabiesDuckembryo,rabbitorhumandiploidInactivatedAdenovirusCC(Humandiploidcells)LiveattenuatedJapaneseBencephalitisMousebrain(formalinized),CCInactivatedVenezuelanequinecephalomyelitisGuineapigheartcellcultureLiveattenuatedEasternequineChickenembryocellcultureInactivatedWesternequineChickenembryocellcultureInactivatedRussianspring-summerencephalitisMousebrain(formalinize)InactivatedTC-tissuecultureCC-cellcultureSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史：近代生物技術(shù)26生化制藥：早期蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)，采用生化分離技術(shù)，從生物體構(gòu)成中分離、純化、制備用于疾病預(yù)防、治療和診斷的生物活性物質(zhì)原上海長(zhǎng)城生化制藥廠（1980）：抑肽酶：牛肺臟，胰蛋白酶抑制劑，胰腺炎細(xì)胞色素C：豬心臟，營養(yǎng)不良現(xiàn)代生物技術(shù)基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)1953年：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；1966年：破譯了DNA三聯(lián)體密碼，隨之證明遺傳的中心法則；1973年：建立了體外重組DNA方法；1982年：重組人胰島素投放市場(chǎng)，由此開啟重組蛋白質(zhì)藥物時(shí)代重組DNA技術(shù)日臻成熟；微生物發(fā)酵技術(shù)；大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；人類基因組計(jì)劃。27從生化制藥到生物技術(shù)制藥

胰島素（Insulin）

人血清白蛋白（HSA）2829胰島素1921年由Banting

&

Macleod發(fā)現(xiàn)1955年Sanger測(cè)定牛胰島素氨基酸序列A鏈（21AA），B鏈（30AA）二硫鍵連接：A鏈與B鏈之間兩對(duì)，A鏈內(nèi)部一對(duì)胰島素的生理過程：胰島素基因區(qū)位于第11對(duì)染色體短臂胰島β細(xì)胞核DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA從細(xì)胞核移向細(xì)胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成前胰島素原（105AA）經(jīng)過蛋白水解酶剪切生成胰島素原（86AA）；胰島素原隨細(xì)胞漿微泡進(jìn)入高爾基體，由蛋白水解酶剪切生成胰島素和C肽；在血糖刺激之下，β細(xì)胞分泌胰島素，進(jìn)入血液循環(huán)

30非人源胰島素的臨床應(yīng)用第一代胰島素（動(dòng)物胰島素）1922年動(dòng)物胰島素開始用于糖尿病臨床治療直至80年代初，醫(yī)用胰島素都是來自豬、牛胰臟提取不同種屬哺乳動(dòng)物胰島素分子的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)稍有差異，其中豬胰島素與人的最為接近（1-4個(gè)AA差異）主要問題容易發(fā)生免疫反應(yīng)，包括過敏反應(yīng)和抗異源胰島素抗體形成（胰島素作用失效，與胰島素抵抗不是一碼事）注射部位皮下脂肪萎縮或增生容易反復(fù)發(fā)生高血糖和低血糖31人胰島素第二代胰島素20世紀(jì)80年代，通過基因工程（重組DNA技術(shù)）將人胰島素基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞表達(dá)高純度的合成人胰島素；酵母：微生物發(fā)酵過程中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)免疫反應(yīng)低，較少誘發(fā)免疫反應(yīng)（包括過敏反應(yīng)），注射劑量比動(dòng)物胰島素平均減少30%，皮下脂肪萎縮的現(xiàn)象也隨之減少；人胰島素的穩(wěn)定性高于動(dòng)物胰島素；主要問題：在起效時(shí)間、峰值時(shí)間、作用持續(xù)時(shí)間上仍不能模擬生理性胰島素分泌模式，使用也不方便32人胰島素類似物第三代胰島素20世紀(jì)90年代末，基于對(duì)人胰島素結(jié)構(gòu)與功能的深入了解，研制更適合人體生理需要、更方便使用的胰島素類似物利用基因工程技術(shù)改變胰島素肽鏈上某些位點(diǎn)的氨基酸組合（蛋白質(zhì)工程），改變等電點(diǎn)，增加六聚體強(qiáng)度；以鈷離子替代鋅離子；在分子中增加脂肪酸鏈，加大與白蛋白的結(jié)合；口服劑型（腸道生物利用率過低）33人血清白蛋白（HSA）理化性質(zhì)：?jiǎn)捂湺嚯模?85AA）分子量66kD血漿唯一非糖基化蛋白質(zhì)濃度范圍35-50g/L含量約占血漿總蛋白的60%生理特性：在肝臟合成，半衰期約為20天；維持血液正常的滲透壓；運(yùn)輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和非水溶性藥物分子等34人血清白蛋白（HSA）在臨床上，人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補(bǔ)充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑；適應(yīng)癥：用于失血性休克、腦水腫、流產(chǎn)引起的白蛋白缺乏、腎病等；用量用法：靜注或靜滴：用量視病情而定；規(guī)格：注射液，每支（瓶）25%20ml。35天然人血清白蛋白的提取純化工藝BritishJournalofAnaesthesia85(6):887-95(2000)現(xiàn)代純化技術(shù)36人血清白蛋白（HSA）從人血清提取白蛋白的主要問題生物污染風(fēng)險(xiǎn)：傳染病原體如HIC、HBV、HCV等高原料成本：人血漿原料昂貴，來源有限雜質(zhì)：雜質(zhì)種類多，含量高生產(chǎn)成本：純化成本一般占生產(chǎn)成本的50%以上37人血清白蛋白（HSA）基因工程酵母大規(guī)模發(fā)酵：酵母屬于微生物，易培養(yǎng)，繁殖快，遺傳背景比較清楚，便于基因工程操作

構(gòu)建HSA基因表達(dá)載體；轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞；酵母細(xì)胞將HSA基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成多肽鏈；酵母細(xì)胞具有真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯后加工能力，包括多肽鏈正確折疊（蛋白質(zhì)活性）的胞內(nèi)環(huán)境和糖基化修飾系統(tǒng)（對(duì)某些蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要），但HSA無需糖基化；酵母細(xì)胞具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物分泌機(jī)制，無需破碎細(xì)胞，產(chǎn)物濃度高，雜質(zhì)含量低，利于降低純化難度和成本；酵母大規(guī)模發(fā)酵屬于成熟工業(yè)技術(shù)；生物污染風(fēng)險(xiǎn)極低。38生化制藥的局限性原料來源有限，尤其是種屬特異性高的藥用蛋白（如hGH）即使是異種屬蛋白質(zhì)藥物（如豬胰島素），目標(biāo)蛋白質(zhì)在原料中的含量相對(duì)極低，而且雜質(zhì)種類多、總含量高，不利于目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化，回收率低，因此生產(chǎn)效率低下，成本高，不利于商業(yè)化生產(chǎn)并滿足市場(chǎng)需求（純化成本一般占生產(chǎn)成本50%以上，牢記）原料來源：依原料性質(zhì)而論安全風(fēng)險(xiǎn)：原料生物污染瘋牛病/病毒污染/其它微生物污染豬很可能是人-禽類病毒傳染的媒介避免動(dòng)物來源原料是生物制藥行業(yè)的總體趨勢(shì)39生物技術(shù)制藥的優(yōu)越性開發(fā)安全、高效、低成本生產(chǎn)工藝，始終是促進(jìn)生物制藥行業(yè)發(fā)展的主要推動(dòng)力原料：來源穩(wěn)定，不受季節(jié)影響，成分明確，非動(dòng)物工藝：過程重復(fù)性好，生產(chǎn)穩(wěn)定，過程可放大以滿足大規(guī)

模商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)率：目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度高，益于純化，高收率雜質(zhì)：宿主細(xì)胞蛋白藥物安全性：免疫原性：非人源糖型有可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)宿主內(nèi)源性病毒明確（如嚙齒類逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒），純化工藝將其控制在安全范圍之內(nèi)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA控制在安全范圍從生產(chǎn)原料上阻斷生物污染（如病毒）40

在蛋白質(zhì)藥物商業(yè)化生產(chǎn)中，借助于基因工程技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與微生物發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)藥物，不但無限拓寬了蛋白質(zhì)藥物品種，也能在質(zhì)量控制體系（GMP）的框架之內(nèi)高效、低成本生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)藥物，幾乎全面取代生化制藥（臟器藥物提?。；蚬こ蹋ㄖ亟MDNA技術(shù)）以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因（DNA片段，轉(zhuǎn)基因），按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖（基因表達(dá)載體），在體外構(gòu)建成雜交DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以細(xì)胞自有機(jī)制對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯，甚至后修飾、分泌。宿主細(xì)胞選擇原核：E.coli真核：哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母414242遺傳信息傳遞43蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：按照基因上遺傳密碼的排序，不同氨基酸通過肽鍵連接成線性序列；二級(jí)結(jié)構(gòu)：依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團(tuán)間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要為α-螺旋和β-折疊等；三級(jí)結(jié)構(gòu)：通過多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元素在三維空間的排列所形成的一個(gè)蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)分子或亞基）。四級(jí)結(jié)構(gòu)：用于描述由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物分子。44蛋白質(zhì)翻譯后修飾在翻譯完成之后，前體蛋白通常沒有活性，需要一系列的翻譯后加工步驟，才能具有生物學(xué)功能；翻譯后加工類型：N-端Met的切除二硫鍵的形成肽鏈剪切化學(xué)修飾：引入官能團(tuán)，以改變蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)磷酸化、硫酸化、醋酸化、烷基化、乙酰化、生物素化、硫辛酸化等糖基化：糖蛋白質(zhì)普遍存在45蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)與寡糖結(jié)合方式：數(shù)十個(gè)基因參與O-糖苷鍵：絲氨酸、蘇氨酸的羥基與糖的半縮醛羥基N-糖苷鍵：天冬酰胺的酰胺基與糖的半縮醛羥基同一糖基化位點(diǎn)糖基結(jié)構(gòu)可能不同（microheterogeinity）并非所有糖基化位點(diǎn)全部占用，同蛋白分子可能有不同糖基化組合（macroheterogeinity）46蛋白質(zhì)糖基化糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的影響：細(xì)胞內(nèi)：糖基化在肽鏈（ER）翻譯與折疊的同時(shí)即已開始，以影響多肽的溶解性、聚集和折疊產(chǎn)物的穩(wěn)定性糖基化對(duì)蛋白質(zhì)分子在血液循環(huán)中的半衰期影響甚大非糖基化蛋白質(zhì)比糖基化蛋白質(zhì)更快被肝臟截獲，糖鏈末端唾液酸化可以降低肝臟對(duì)蛋白質(zhì)的截獲糖基化為許多蛋白質(zhì)生物活性所必需IgG：與補(bǔ)體和Fc受體結(jié)合（ADCC）所必需Epo：生物活性所必需47蛋白質(zhì)糖基化糖基的免疫原性（Antigenicity）絕大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物系糖蛋白質(zhì)；細(xì)胞內(nèi)糖基化酶系高度保守，糖型具有種屬特異性；非人細(xì)胞所表達(dá)蛋白質(zhì)有可能因糖型差異而引發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗體，其后果是蛋白質(zhì)藥物被抗體中和而失效；重組蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)必須采用適當(dāng)細(xì)胞株，避免或最大限度降低由糖基引起的免疫原性48重組蛋白質(zhì)藥物表達(dá)主要細(xì)胞（株）來源細(xì)胞（株）注釋中國倉鼠ChineseHamsterOvary（CHO）由于歷史原因，CHO細(xì)胞是目前采用最多的生產(chǎn)細(xì)胞株。非人源糖型，免疫原性未引起大問題人HEK293,PerC6人源糖型，潛力巨大小鼠NS0,SP2/0,hybridomas非人源糖型，免疫原性很低敘利亞倉鼠BHK昆蟲Sf9,Hi-Five非人源糖型，疫苗（抗原）表達(dá)酵母畢赤酵母非人源糖型，非糖基化蛋白質(zhì)或疫苗（抗原）表達(dá)細(xì)菌大腸桿菌形成包涵體，非糖基化、無二硫鍵蛋白質(zhì)表達(dá)，二硫鍵可在氧化復(fù)性環(huán)境或伴侶蛋白協(xié)助下形成4949MolecularCellBiology(5thed.)byLodishetal.原核細(xì)胞-真核細(xì)胞5050蛋白質(zhì)產(chǎn)物分子量真核：基本上對(duì)分子量沒限制原核：適合表達(dá)分子量低于5KD的蛋白質(zhì)多肽翻譯后修飾機(jī)制真核：YES，但種屬差異很大原核：NO后修飾為許多蛋白質(zhì)功能所必需如抗體、促血紅素產(chǎn)物分泌機(jī)制真核：YES，蛋白質(zhì)以天然構(gòu)象形式分泌至胞外原核：NO，缺乏多肽鏈正確折疊與二硫鍵正確連接的機(jī)制，多肽以包涵體形式存在，后續(xù)加工包括細(xì)胞破碎、包涵體溶解、蛋白質(zhì)復(fù)性，工藝復(fù)雜，成本高真核與原核細(xì)胞基因表達(dá)的主要差別生物技術(shù)藥物的特性分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜：分子量較大；分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除肽鏈之外，可能還有二硫鍵連接以及翻譯后修飾如糖基化、磷酸化等具有種屬特異性：治療針對(duì)性強(qiáng)、療效高：生物藥物是天然存在的蛋白質(zhì)或多肽，量微且生物活性強(qiáng)，極小用量就會(huì)產(chǎn)生顯著效應(yīng)，相對(duì)來說不良反應(yīng)較少，毒性較低，安全性較好；穩(wěn)定性低：易變性失活，易被蛋白酶破壞，易微生物污染；51生物技術(shù)藥物的特性

5.基因穩(wěn)定性：生產(chǎn)菌株或細(xì)胞系的穩(wěn)定性和生產(chǎn)條件的穩(wěn)定性非常重要，變異會(huì)導(dǎo)致藥物生物活性的變化或不希望的生物學(xué)活性。6.免疫原性：一些人源性蛋白質(zhì)在人體中也能產(chǎn)生抗體，重組藥物可能與天然蛋白質(zhì)存在結(jié)構(gòu)和構(gòu)象上的差異；7.體內(nèi)半衰期短：生物藥物降解迅速，體內(nèi)降解的部位廣泛；8.受體效應(yīng)：許多生物藥物是通過與特異性受體結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制而發(fā)揮藥效作用，且受體分布具有動(dòng)物種屬特異性和組織特異性，因此在體內(nèi)有組織特異性和藥效反應(yīng)快的特點(diǎn)；52生物技術(shù)藥物的特性

9.多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)：許多生物藥物作用于多種組織或細(xì)胞，且在體內(nèi)相互誘生、調(diào)節(jié)、協(xié)同或頡頏，形成網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，從而具有多種功能、多種藥理作用；10.檢驗(yàn)的特殊性：生產(chǎn)系統(tǒng)復(fù)雜，生產(chǎn)批次間的一致性及安全性的變化大于化學(xué)產(chǎn)品，因此，對(duì)生產(chǎn)過程的監(jiān)測(cè)、GMP步驟的要求和質(zhì)控的要求更為重要和嚴(yán)格。53非動(dòng)物宿主細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物54Drug(Tradename)Activity/UseGranulocytecolony-stimulatingfactor(Neupogen)WhitebloodcellgrowthforneutropeniaInsulin(Humulin)Diabetes-Interferon(Intron-A)Anticancer,viralinfectionsSomatotropin(Humatrope)GrowthdeficienciesSomatotropin(Protopin/Nutropin)GrowthdeficienciesInterleukin-2(Proleukin)KidneycancerSource:CellCultureBioprocessingEngineering,2012動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)非抗體蛋白質(zhì)藥物55Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameTypeTherapeuticuseManufacturerUSapprovalHostActivaseTissueplasminogenactivatorAcutemyocardialinfarctionGenentech1987CHOEpogen/ProcritEPOAnemiaAmgen/OrthoBiotech1989CHOPulmozymeDeoxyribonucleaseICysticfibrosisGenentech1993CHOCerezyme-glucocerebrosidaseGaucher’sdiseaseGenzyme1994CHOAvonexInterferon-RelapsingmultiplesclerosisBiogenIdec1996CHOFollistim/Gonal-FFolliclestimulatinghormoneInfertilitySerono/NVOrganon1997CHOEnbrelTNFreceptorfusionRheumatoidarthritisAmgen,Wyeth1998CHOBenefixFactorIXHemophiliaAWyeth2000CHOTenecteplaseTissueplasminogenactivator

(engineered)AcutemyocardialinfarctionGenentech2000CHOReFactoFactorVIIIHemophiliaAWythe2000CHOAranespEPO(engineered)AnemiaAmgen2001CHORebifInterferon-RelapsingmultiplesclerosisSerono2002CHOFabrazyme-galactosidaseFabrydiseaseGenzyme2003CHOAdvateFactorVIII(engineered)HemophiliaABaxter2003CHOLuverisLuteinizinghormoneInfertilitySerono2004CHONaglazymeN-acetylgalactosamine4-sulfataseMucopolysaaccharidosisVIBioMarin2005CHOOrenciaIg-CTLA44fusionRheumatoidarthritisBristol-MyersSquibb2005CHOMyozyme-galactosidasePompe’sdiseaseGenzyme2006CHOAldurazymeLaronidaseMucopolysaaccharidosisIGenzyme2006CHO動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體藥物（早期）56Source:CellCultureBioprocessingEngineering,2012TradenameMabTypeTherapeuticuseManufacturerUSHostOKT3Anti-CD3,MurineAcutekidneytransplantrejectionJ&J1986HybridomaReoProAnti-AbciximabPreventionofbloodclotsCentocor1994SP2/0RituxanAnti-CD20Non-Hodgkin’slymphomaGenentech1997CHOZenapaxHumanized,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionPDL1997NS0SimulectChimeric,anti--chain,IL-2receptorAcutekidneytransplantrejectionNovartis1998SynagisHumanized,anti-A-antigenofRSVLowerrespiratorytractdiseaseMedImmune1998CHORemicadeAnti-TNF-ActiveCrohn’sdiseaseCentocor1998SP2/0HerceptinAnti-HER2MetastaticbreastcancerGenentech1998CHOMylotargAnti-CD33AcutemyeloidleukemiaWythe2000CHOCampathAnti-CD52ChroniclymphocyticleukemiaMillennium2001CHOZevalinAnti-CD20,murineNon-Hodgkin’slymphomaBiogenIdec2002CHOHumiraAnti-TNF-RheumatoidarthritisAbbott2002CHOXolairHumanized,anti-IgEModerate/severeasthemaGenzyme2003CHOBEXXARAnti-CD20FollicularNon-Hodgkin’slymphomaGSK2003CHORaptivaAnti-CD11aChronicpsoriasisGenentech2003CHOErbituxChimericmAbanti-hEGFreceptorEGFRexpressingmetastaticcolorectalcancerBMS,Merck2004CHOAvastinAnti-VEGFMetastaticcolorectal&lungcancerGenentech2004CHOVectibixAnti-EGFRMetastaticcolorectalcancerAmgen2006CHOSolirisAnti-CD5ParoxysmalnocturnalhemoglobinuriaAlexion2007NS0抗體藥物雜交瘤細(xì)胞與單克隆抗體Kohler&

Milstein（1975）將小鼠骨髓瘤細(xì)胞（有分裂增殖能力）與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞（B細(xì)胞，分泌單一種抗體）融合，形成即能增殖又能分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；抗原-抗體結(jié)合具有極高特異性與親和力，抗體可以成為靶向藥物的基礎(chǔ)（生物導(dǎo)彈）。57抗體藥物作用機(jī)制58中和效應(yīng)因子：抗體與腫瘤壞死因子（TNF-）結(jié)合，使其不能再與細(xì)胞表面受體結(jié)合，減緩炎癥，適用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和克羅恩病；腫瘤生物治療：抗體可以負(fù)載細(xì)胞毒性藥物或放射性，在腫瘤組織上與表面抗原結(jié)合、富集、殺傷腫瘤細(xì)胞；抗體錨定腫瘤組織之后，其Fc與天然免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）表面Fc受體結(jié)合，誘發(fā)后者殺傷效應(yīng)；封閉T淋巴細(xì)胞表面PD-1或腫瘤組織表面PD-L1，阻止腫瘤細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的壓制，達(dá)到T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷效應(yīng)。南開大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)工程細(xì)胞培養(yǎng)工程N(yùn)ature480(22):480-489,29December2011CancerimmunotherapycomesofageMellman,Coukos&Dranoff60激活或抑制T淋巴細(xì)胞功能的抗體藥物對(duì)于腫瘤治療具有很好的前景已處于臨床試驗(yàn)階段抗體藥物6161抗體藥物類型抗體藥物類型演化降低種屬差異免疫反應(yīng)提高藥效OKT3鼠源抗體免疫反應(yīng)使其作用失效抗體工程：IgG抗體結(jié)構(gòu)與功能干細(xì)胞與組織工程

特殊生物反應(yīng)器專用無血清培養(yǎng)基腫瘤免疫治療（DC-CIK）636464現(xiàn)代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

生物醫(yī)藥工業(yè)的主要技術(shù)構(gòu)成分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)基因表達(dá)機(jī)制基因表達(dá)載體構(gòu)建宿主細(xì)胞設(shè)計(jì)：CHO：DHFR雙敲除CHO/NS0：GS系統(tǒng)PERC6，HEK293蛋白質(zhì)純化親和層析：Protein-A/G;AKTA：提高純化工藝過程開發(fā)速度和質(zhì)量；更多的樹脂選擇；膜技術(shù)：過濾、濃縮。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞株構(gòu)建與篩選合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基