2015遺傳學(xué)實驗-細(xì)胞與

細(xì)胞與遺傳實驗

實驗室要求點名穿白大衣課上保持安靜愛護公物，實驗完畢物歸原處課后由值日生清潔實驗室細(xì)胞與遺傳實驗課要求以小組形式完成系統(tǒng)性實驗并作好實驗記錄按時完成實驗報告（下次實驗課交）

實驗安排（進度）第1、2周活細(xì)胞觀察、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、細(xì)胞計數(shù)第3、4周不同應(yīng)激對細(xì)胞活力的影響及應(yīng)激影響細(xì)胞活力的機制探討第5、6周翻譯文獻、實驗設(shè)計（作業(yè))第7、8周Bax在不同細(xì)胞中表達差異的檢測第9、10周微核檢測、傳代細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備第11、12周遺傳病致病基因檢測（DNA提?。┑?3、14周遺傳病致病基因檢測（PCR法）作業(yè)：查閱文獻及翻譯文獻來自近兩年的權(quán)威雜志，如Science、Cell、Nature等，及其子刊文獻以不少于四頁為好，不包括參考文獻第4次實驗課交實驗（一）活細(xì)胞觀察細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)

取活體動物組織，在體外，無菌條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境（營養(yǎng)、激素、滲透壓、溫度、pH值、氣體），對其進行培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠生存、生長、繁殖并保持原來生物學(xué)特性的一種實驗方法（原代、傳代）。細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)容細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察、活力測定細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞生長曲線、分裂指數(shù)細(xì)胞凍存與復(fù)蘇等等細(xì)胞全生存過程：原代、傳代、衰退期細(xì)胞原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）：在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細(xì)胞，經(jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接種培養(yǎng)器血中（取材），從機體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在支持物表面長滿后，進行重新分配，再培養(yǎng)的過程。（所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，與細(xì)胞倍增一代非同一含義）傳代后對培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間進行觀察，肉眼、鏡下觀察：細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（酚紅），培養(yǎng)溫度、CO2濃度等原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系潛伏期（LatentPhase）：細(xì)胞懸浮-貼附—細(xì)胞可運動但基本無增殖，潛伏期時間長短與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。指數(shù)生長期（LogarithmicgrowthPhase）：細(xì)胞增值最旺盛的階段，以細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（MitoticIndex）表示，即細(xì)胞群中每100個細(xì)胞中的分裂相百分比數(shù)。接觸抑制（ContactInhibition）：正常細(xì)胞有，惡性細(xì)胞無

密度抑制（DensityInhibition）停滯期（StagnatePhase）：細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，直至將培養(yǎng)液中營養(yǎng)物消耗殆盡衰亡凍存、復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進入衰退期。細(xì)胞生長曲線：測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。細(xì)胞生長曲線可以準(zhǔn)確描述整個過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，以存活細(xì)胞數(shù)(萬/mL)對應(yīng)培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。實驗室基本條件無菌環(huán)境儀器設(shè)備普通器材一般試劑無菌環(huán)境無菌室無菌操作無菌室結(jié)構(gòu)圖back超靜工作臺二氧化碳培養(yǎng)箱液氮罐back

器材back

試劑back

無菌操作

無菌間及超凈臺消毒（紫外燈。。。。）洗手著裝試劑瓶等斜放（超凈臺中物品擺放次序。。。）酒精棉消毒近火焰操作注意：不要將超凈臺中物品拿出。。。

一、活細(xì)胞觀察體外培養(yǎng)的、生長中的細(xì)胞，借助顯微鏡來進行察看、比較、判斷，以求對細(xì)胞做出進一步處理（換液？傳代。。。）器材倒置顯微鏡培養(yǎng)細(xì)胞株方法肉眼觀察顯微鏡下觀察肉眼觀察培養(yǎng)液清濁度（支原體、細(xì)菌、真菌。。。）培養(yǎng)液顏色顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度細(xì)胞的透明度（折光性。。。）細(xì)胞的形狀L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)--細(xì)胞呈梭型貼壁生長A549---人肺癌細(xì)胞（倒置顯微鏡X10）------細(xì)胞呈梭形，有偽足，貼壁生長PC-12---大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞---倒置顯微鏡X10---細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，貼壁生長，生長速度快

人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2細(xì)胞--熒光顯微鏡40*--細(xì)胞多角形，貼壁良好

宮頸癌HeLa細(xì)胞---貼壁生長，呈多角形

B－NHL(非何杰金淋巴瘤細(xì)胞株)--熒光顯微鏡顯微鏡X40；Hoechst33258染色---細(xì)胞呈圓形，成團生長Molt4細(xì)胞--成人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株--細(xì)胞呈葡聚狀生長，懸浮細(xì)胞，聚集呈團，如單個散開分布示狀態(tài)不好

二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞在支持物表面長滿后，進行重新分配，再培養(yǎng)的過程。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。（懸浮型、貼壁型）

器材與試劑：超凈工作臺二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡細(xì)胞株（HeLa細(xì)胞）滴管、培養(yǎng)瓶、瓶塞等（無菌）培養(yǎng)液：10%小牛血清DMEM（無菌）消化液：0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）（無菌）操作(無菌)

細(xì)胞株——棄原培養(yǎng)液（可PBS或D-Hanks洗）——加胰旦白酶液（消化細(xì)胞）——棄胰旦白酶液（靜置1-2min。。。，倒置顯微鏡觀察）——定量加入培養(yǎng)液1ml，沖打細(xì)胞成懸液（適度、打勻、盡量不要產(chǎn)生氣泡）——取1滴細(xì)胞懸液進行細(xì)胞計數(shù)——按需接種至新培養(yǎng)瓶（皿）——補足新鮮培養(yǎng)液（一傳二，3ml/瓶）——37℃培養(yǎng)——觀察細(xì)胞生長情況0.5min細(xì)胞傳代消化法示意圖

顯微鏡下細(xì)胞消化前后示意圖注意1、無菌操作2、胰蛋白酶消化時間要嚴(yán)格控制(鏡下觀察、時間長影響細(xì)胞貼壁)(溫度、pH、濃度；0.02%EDTA---細(xì)胞成團時)3、吹打細(xì)胞要適度4、對于狀態(tài)不好的細(xì)胞可分次消化。。。5、影響細(xì)胞生長的因素：培養(yǎng)基（營養(yǎng)、激素、滲透壓、pH值）、溫度、氣體、細(xì)胞接種密度、加入培養(yǎng)液的量、換液的掌握。。。三、細(xì)胞計數(shù)

細(xì)胞的傳代、凍存、生化研究及生長曲線制作等，都需對細(xì)胞進行計數(shù)。細(xì)胞的多少對實驗結(jié)果會有影響。儀器血球計數(shù)板普通光學(xué)顯微鏡材料和試劑細(xì)胞株（HeLa細(xì)胞）0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液操作

單層細(xì)胞——胰蛋白酶液消化細(xì)胞——棄胰酶——定量加入培養(yǎng)液（1-2ml）——輕輕吹打細(xì)胞（單細(xì)胞懸液）——取少許懸液計數(shù)細(xì)胞

——根據(jù)傳代所需細(xì)胞進行稀釋。。。

計算公式細(xì)胞數(shù)/毫升＝（４大格細(xì)胞數(shù)÷4）×104

1ml＝1000mm3每格體積=1×1×0.1=0.1mm3=10-4ml注意：培養(yǎng)