2015遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞與

細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室要求點(diǎn)名穿白大衣課上保持安靜愛(ài)護(hù)公物，實(shí)驗(yàn)完畢物歸原處課后由值日生清潔實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn)課要求以小組形式完成系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)并作好實(shí)驗(yàn)記錄按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告（下次實(shí)驗(yàn)課交）

實(shí)驗(yàn)安排（進(jìn)度）第1、2周活細(xì)胞觀察、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)第3、4周不同應(yīng)激對(duì)細(xì)胞活力的影響及應(yīng)激影響細(xì)胞活力的機(jī)制探討第5、6周翻譯文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（作業(yè))第7、8周Bax在不同細(xì)胞中表達(dá)差異的檢測(cè)第9、10周微核檢測(cè)、傳代細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備第11、12周遺傳病致病基因檢測(cè)（DNA提?。┑?3、14周遺傳病致病基因檢測(cè)（PCR法）作業(yè)：查閱文獻(xiàn)及翻譯文獻(xiàn)來(lái)自近兩年的權(quán)威雜志，如Science、Cell、Nature等，及其子刊文獻(xiàn)以不少于四頁(yè)為好，不包括參考文獻(xiàn)第4次實(shí)驗(yàn)課交實(shí)驗(yàn)（一）活細(xì)胞觀察細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)

取活體動(dòng)物組織，在體外，無(wú)菌條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境（營(yíng)養(yǎng)、激素、滲透壓、溫度、pH值、氣體），對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠生存、生長(zhǎng)、繁殖并保持原來(lái)生物學(xué)特性的一種實(shí)驗(yàn)方法（原代、傳代）。細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)容細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察、活力測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、分裂指數(shù)細(xì)胞凍存與復(fù)蘇等等細(xì)胞全生存過(guò)程：原代、傳代、衰退期細(xì)胞原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）：在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接種培養(yǎng)器血中（取材），從機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在支持物表面長(zhǎng)滿(mǎn)后，進(jìn)行重新分配，再培養(yǎng)的過(guò)程。（所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，與細(xì)胞倍增一代非同一含義）傳代后對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間進(jìn)行觀察，肉眼、鏡下觀察：細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（酚紅），培養(yǎng)溫度、CO2濃度等原代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱(chēng)之為細(xì)胞系潛伏期（LatentPhase）：細(xì)胞懸浮-貼附—細(xì)胞可運(yùn)動(dòng)但基本無(wú)增殖，潛伏期時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。指數(shù)生長(zhǎng)期（LogarithmicgrowthPhase）：細(xì)胞增值最旺盛的階段，以細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（MitoticIndex）表示，即細(xì)胞群中每100個(gè)細(xì)胞中的分裂相百分比數(shù)。接觸抑制（ContactInhibition）：正常細(xì)胞有，惡性細(xì)胞無(wú)

密度抑制（DensityInhibition）停滯期（StagnatePhase）：細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，直至將培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物消耗殆盡衰亡凍存、復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過(guò)短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過(guò)長(zhǎng)短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以準(zhǔn)確描述整個(gè)過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，以存活細(xì)胞數(shù)(萬(wàn)/mL)對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間(h或d)作圖，即得生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)室基本條件無(wú)菌環(huán)境儀器設(shè)備普通器材一般試劑無(wú)菌環(huán)境無(wú)菌室無(wú)菌操作無(wú)菌室結(jié)構(gòu)圖back超靜工作臺(tái)二氧化碳培養(yǎng)箱液氮罐back

器材back

試劑back

無(wú)菌操作

無(wú)菌間及超凈臺(tái)消毒（紫外燈。。。。）洗手著裝試劑瓶等斜放（超凈臺(tái)中物品擺放次序。。。）酒精棉消毒近火焰操作注意：不要將超凈臺(tái)中物品拿出。。。

一、活細(xì)胞觀察體外培養(yǎng)的、生長(zhǎng)中的細(xì)胞，借助顯微鏡來(lái)進(jìn)行察看、比較、判斷，以求對(duì)細(xì)胞做出進(jìn)一步處理（換液？傳代。。。）器材倒置顯微鏡培養(yǎng)細(xì)胞株方法肉眼觀察顯微鏡下觀察肉眼觀察培養(yǎng)液清濁度（支原體、細(xì)菌、真菌。。。）培養(yǎng)液顏色顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度細(xì)胞的透明度（折光性。。。）細(xì)胞的形狀L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)--細(xì)胞呈梭型貼壁生長(zhǎng)A549---人肺癌細(xì)胞（倒置顯微鏡X10）------細(xì)胞呈梭形，有偽足，貼壁生長(zhǎng)PC-12---大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞---倒置顯微鏡X10---細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快

人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2細(xì)胞--熒光顯微鏡40*--細(xì)胞多角形，貼壁良好

宮頸癌HeLa細(xì)胞---貼壁生長(zhǎng)，呈多角形

B－NHL(非何杰金淋巴瘤細(xì)胞株)--熒光顯微鏡顯微鏡X40；Hoechst33258染色---細(xì)胞呈圓形，成團(tuán)生長(zhǎng)Molt4細(xì)胞--成人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株--細(xì)胞呈葡聚狀生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞，聚集呈團(tuán)，如單個(gè)散開(kāi)分布示狀態(tài)不好

二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞在支持物表面長(zhǎng)滿(mǎn)后，進(jìn)行重新分配，再培養(yǎng)的過(guò)程。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。（懸浮型、貼壁型）

器材與試劑：超凈工作臺(tái)二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡細(xì)胞株（HeLa細(xì)胞）滴管、培養(yǎng)瓶、瓶塞等（無(wú)菌）培養(yǎng)液：10%小牛血清DMEM（無(wú)菌）消化液：0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）（無(wú)菌）操作(無(wú)菌)

細(xì)胞株——棄原培養(yǎng)液（可PBS或D-Hanks洗）——加胰旦白酶液（消化細(xì)胞）——棄胰旦白酶液（靜置1-2min。。。，倒置顯微鏡觀察）——定量加入培養(yǎng)液1ml，沖打細(xì)胞成懸液（適度、打勻、盡量不要產(chǎn)生氣泡）——取1滴細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)——按需接種至新培養(yǎng)瓶（皿）——補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液（一傳二，3ml/瓶）——37℃培養(yǎng)——觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況0.5min細(xì)胞傳代消化法示意圖

顯微鏡下細(xì)胞消化前后示意圖注意1、無(wú)菌操作2、胰蛋白酶消化時(shí)間要嚴(yán)格控制(鏡下觀察、時(shí)間長(zhǎng)影響細(xì)胞貼壁)(溫度、pH、濃度；0.02%EDTA---細(xì)胞成團(tuán)時(shí))3、吹打細(xì)胞要適度4、對(duì)于狀態(tài)不好的細(xì)胞可分次消化。。。5、影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)、激素、滲透壓、pH值）、溫度、氣體、細(xì)胞接種密度、加入培養(yǎng)液的量、換液的掌握。。。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞的傳代、凍存、生化研究及生長(zhǎng)曲線制作等，都需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞的多少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有影響。儀器血球計(jì)數(shù)板普通光學(xué)顯微鏡材料和試劑細(xì)胞株（HeLa細(xì)胞）0.25%胰蛋白酶液（pH7.4）10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液操作

單層細(xì)胞——胰蛋白酶液消化細(xì)胞——棄胰酶——定量加入培養(yǎng)液（1-2ml）——輕輕吹打細(xì)胞（單細(xì)胞懸液）——取少許懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞

——根據(jù)傳代所需細(xì)胞進(jìn)行稀釋。。。

計(jì)算公式細(xì)胞數(shù)/毫升＝（４大格細(xì)胞數(shù)÷4）×104

1ml＝1000mm3每格體積=1×1×0.1=0.1mm3=10-4ml注意：培養(yǎng)