熒光顯微技術(shù)

熒光顯微鏡熒光顯微鏡

利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?/p>

濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭

熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)隔熱濾光片：阻斷紅外線通過(guò)而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過(guò)紫外線可見波長(zhǎng)的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡濾光片熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)一.熒光顯微鏡的原理某些物質(zhì)在一定短波長(zhǎng)的光(如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光(如見光)，這種光就稱為熒光。

熒光顯微鏡利用特殊的照明裝置發(fā)出較短波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光,通過(guò)物鏡作用在樣品上，在有目鏡觀察到肉眼可見的熒光。二.熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)主要結(jié)構(gòu)有機(jī)械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩部分，如圖

1.機(jī)械系統(tǒng)：包括底座、鏡身、觀察筒三部分

2.光學(xué)系統(tǒng):包括物鏡、聚光鏡、光源等三.熒光顯微鏡的操作及注意事項(xiàng)1．基本操作步驟

(1)安裝紫外防護(hù)罩。

(2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。

(3)插入擋光板，中斷光路。

(4)預(yù)熱5—10分鐘。

(5)將載有樣品的載玻片放到載物臺(tái)上。

(6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。

(7)旋轉(zhuǎn)分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時(shí)用；“WU”為觀察藍(lán)色熒光時(shí)用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時(shí)用(如FITC)；“WG"為觀察紅色熒光時(shí)用(如TRITC)。

(8)使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)。

(9)通過(guò)粗、細(xì)螺旋調(diào)整焦距。

(10)打開與顯微鏡連接的計(jì)算機(jī)，點(diǎn)擊數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)碼圖像。2.注意事項(xiàng)

(1)因觀察熒光使用的光源為高壓汞燈，其中發(fā)出的光含紫外光，對(duì)人眼有損害作用，故必須安裝紫外防護(hù)罩。

(2)為延長(zhǎng)汞燈壽命，打開汞燈后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15分鐘后才能關(guān)閉。

(3)汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)，否則燈內(nèi)汞蒸氣尚未恢復(fù)到液態(tài)，內(nèi)阻極小，再次施加電壓，會(huì)引起短路，導(dǎo)致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器，更重要的是汞蒸氣溢出，將導(dǎo)致工作室污染。故關(guān)閉汞燈之后，不能馬上再次打開，必須等待至少30分鐘。

(4)高壓汞燈工作時(shí)會(huì)散發(fā)大量的熱量，因此，工作環(huán)境溫度不宜太高，必須有良好的散熱條件。

(5)汞燈的使用壽命約200—300小時(shí)，在電源控制箱上有時(shí)間累計(jì)計(jì)數(shù)器，使用者要記錄累計(jì)小時(shí)數(shù)，達(dá)到300小時(shí)，需更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察四.熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。（三）標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。五.熒光顯微鏡應(yīng)用技術(shù)1.

對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性位、半定量研究免疫熒光技術(shù)

用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣品(細(xì)胞、組織或分離的物質(zhì)等)中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合，以適當(dāng)檢測(cè)熒光的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測(cè)相應(yīng)特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(shù)(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標(biāo)記的第二、第三抗體等檢測(cè)相應(yīng)抗原抗體復(fù)合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(shù)(indirectimmunofluorescenttechnique)”。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位2.作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物。綠色熒光蛋白綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡(jiǎn)稱GFP，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光在生物學(xué)研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有

1.分子標(biāo)記

利用綠色熒光的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察2.藥物篩選

熒光探針?lè)植际抢眯盘?hào)傳導(dǎo)中信號(hào)分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號(hào)分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號(hào)分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對(duì)細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。六、熒光抗體染色間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光抗體染色雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。熒光抗體染色

設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

區(qū)分特異和非特異染色

陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色①自身抗體檢測(cè)抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用②病原體檢測(cè)寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用③免疫病理檢測(cè)腫瘤（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用七、熒光原位雜交概念：原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單