薄層色譜掃描法

薄層色譜掃描法中藥二室

一、薄層色譜掃描法簡(jiǎn)介二、影響薄層掃描定量的因素三、介紹CAMAG薄層掃描儀一、薄層色譜掃描法簡(jiǎn)介1、簡(jiǎn)述

薄層色譜掃描法是指用一束一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的紫外或可見(jiàn)光對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，測(cè)定薄層板上的樣品斑點(diǎn)對(duì)光的吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。所得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查及含量測(cè)定。

中藥材：山豆根、槲寄生、女貞子、牛黃、兩面針、黃連等；中成藥：六味地黃丸（濃縮丸）、元胡止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、九分散等;2、檢測(cè)方法(1)吸收法:掃描時(shí)測(cè)定薄層板上的樣品斑點(diǎn)對(duì)光吸收強(qiáng)度的方法。(2)熒光法:測(cè)定樣品斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的方法。(3)熒光淬滅法:利用某些化合物減弱吸附劑中熒光劑的紫外吸收強(qiáng)度而進(jìn)行定量的方法。由于薄層板各部分熒光強(qiáng)度不均勻,對(duì)定量不太適用,而是便于斑點(diǎn)的定位。3、測(cè)量方式

(1)透射法：測(cè)定照射光穿透樣品斑點(diǎn)后光的吸收情況。(2)反射法：樣品斑點(diǎn)對(duì)照射光的反射情況進(jìn)行測(cè)定的方法。4、測(cè)光形式

(1)單波長(zhǎng)掃描：使用一種波長(zhǎng)的光束對(duì)薄層進(jìn)行掃描。適用于分離度好，背景干擾小的薄層色譜。(2)雙波長(zhǎng)掃描：用測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)分別掃描薄層后，測(cè)定樣品斑點(diǎn)在兩波長(zhǎng)下的吸收度之差，可減少分離度欠佳的組分間的相互干擾，并減少薄層板的背景干擾，能顯著改善基線的平穩(wěn)性。操作時(shí)應(yīng)選擇待測(cè)斑點(diǎn)無(wú)吸收或最小吸收的波長(zhǎng)作為參比波長(zhǎng)。5、掃描方式

(1)線性掃描：用一束比待測(cè)斑點(diǎn)略寬的狹窄光帶沿展開方向做單向等速掃描。適于形狀較規(guī)則斑點(diǎn)的掃描。在進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)一般只用線性掃描。(2)鋸齒掃描：使用微小正方形光束沿展開方向掃描的同時(shí)，在垂直于展開方向進(jìn)行往復(fù)式掃描，掃描過(guò)程中光束的運(yùn)動(dòng)軌跡呈鋸齒形或矩形，它對(duì)于形狀不規(guī)則或分布不均勻的斑點(diǎn)掃描重復(fù)性較好，但掃描速度較慢。6、定量方法

(1)外標(biāo)法：如果標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，可用一點(diǎn)法校正；如果不通過(guò)原點(diǎn)，采用二點(diǎn)法校正，必要時(shí)用多點(diǎn)校正法。測(cè)定時(shí)，供試品溶液和對(duì)照品溶液應(yīng)交叉點(diǎn)于同一薄層板上，每份供試品溶液點(diǎn)樣不得少于2個(gè)，對(duì)照品每一濃度不得少于2個(gè)，其計(jì)算結(jié)果的相對(duì)平均偏差不得大于5%。計(jì)算公式:C=kA+b(kA+b)×稀釋倍數(shù)點(diǎn)樣量×稱樣量(2)內(nèi)標(biāo)法：將內(nèi)標(biāo)加入供試品溶液和對(duì)照品溶液中以峰面積的比值為定量依據(jù).由于內(nèi)標(biāo)物的選擇比較困難，目前應(yīng)用較少。內(nèi)標(biāo)物：a.在樣品溶液中加入一種在樣品溶液中不存在的，

b.性質(zhì)與被測(cè)物質(zhì)類似且又與樣品中被測(cè)成分得易分離的純化物，7、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

（1）檢測(cè)靈敏度：指用于限量檢查時(shí)，被測(cè)成分能被檢出的最低量。（2）分離度：用于限量檢查或含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度,應(yīng)大于1.0。（3）重復(fù)性：指同一薄層板上同一供試品溶液相同濃度的數(shù)個(gè)斑點(diǎn)，掃描結(jié)果的偏差。不顯色直接掃描，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%，顯色后掃描，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。二、影響薄層掃描定量的因素

（一）吸附劑性能及薄層質(zhì)量1、吸附劑：（1）吸附劑顆粒大小，分布均勻程度能影響分離度和檢出限度。小顆粒且分布均勻的吸附劑，分離度好，靈敏度高。（2）吸附劑的含水量影響薄層活度，如果大氣濕度過(guò)大，吸附劑含水量過(guò)高，導(dǎo)致薄層活度過(guò)低，就會(huì)影響分離效果，所以在點(diǎn)樣前薄層板應(yīng)進(jìn)行活化在110℃干燥30分鐘。（一）吸附劑性能及薄層質(zhì)量2、薄層：薄層厚度會(huì)影響定量結(jié)果，厚度下降，展開后斑點(diǎn)擴(kuò)散較嚴(yán)重，影響定量結(jié)果。用透射法測(cè)定時(shí)，峰面積值隨薄層厚度下降而減小，用反射法測(cè)定，峰面積值隨薄層厚度下降而增加。因此對(duì)吸附劑及薄層性能的規(guī)格化是薄層色譜重現(xiàn)性及定量準(zhǔn)確性的先決條件。薄層板的種類

硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板、氧化鋁板。硅膠G板以石膏作為黏合劑；硅膠GF254板是添加熒光指示劑；常用的熒光指示劑有兩種:一種是錳激活的硅酸鋅（Zn2SiO4:Mn）,在254nm波長(zhǎng)下能發(fā)出熒光;另一種是銀激活的硫化鋅、硫化鎘（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波長(zhǎng)下能發(fā)出熒光。我們常用的是硅膠GF254板。硅膠H板是沒(méi)有外加黏合劑。氧化鋁板以氧化鋁作為固定相，可以分離萜類，生物堿類，脂肪族及芳香族化合物。（二）點(diǎn)樣

1、一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀;

點(diǎn)樣基線距底邊10-15mm;

圓點(diǎn)狀直徑一般不大于3mm;

條帶寬度一般為5-10mm;

點(diǎn)間距離不少于8mm。2、點(diǎn)樣是薄層色譜的第一步,也是關(guān)鍵的一步,它既關(guān)系到能否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜,也關(guān)系到定量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確與否,點(diǎn)樣量不宜過(guò)大,最好控制在10μl以下,點(diǎn)樣過(guò)多或原點(diǎn)“超載”,展開劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象,使斑點(diǎn)拖尾或重疊,致使掃描峰形不對(duì)稱,或達(dá)不到基線分離。(三)展開

1、預(yù)飽和薄層各個(gè)部分對(duì)展開劑蒸氣的預(yù)吸附程度不同,會(huì)影響色譜分離，因此當(dāng)用展開劑時(shí)，先將薄層及展開缸進(jìn)行預(yù)飽和,以便得到重現(xiàn)的色譜圖。2、相對(duì)濕度：50%-60%較適宜相對(duì)濕度過(guò)大影響薄層活度,吸附劑吸附能力下降,分離效果不理想。3、溫度:一般18-25℃較適宜溫度變化會(huì)影響組分在兩相間的分配,被分離物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.2-0.8較適合,Rf值太大,斑點(diǎn)易擴(kuò)散,掃描重現(xiàn)差,Rf值太小,斑點(diǎn)沒(méi)有完全展開,掃描結(jié)果不能代表真實(shí)濃度。4、邊緣效應(yīng)：同一化合物，在同一塊薄層板上,用同一混合展開劑，在同一展開槽內(nèi)展開后，薄層中間部分的斑點(diǎn)比薄層兩側(cè)邊緣處的斑點(diǎn)的Rf值小。

用展開劑將展開缸及薄層板飽和后再進(jìn)行展開就可以消除邊緣效應(yīng)，飽和時(shí)間的長(zhǎng)短因展開劑極性以及比例不同而異。5、展開劑(1)展開劑過(guò)多次數(shù)的重復(fù)使用，也會(huì)影響Rf值的穩(wěn)定。多次使用展開劑時(shí)，實(shí)際上每一次的展開劑的組成,由于揮發(fā)、吸附等原因已有改變。最好是臨用新配，這樣每次展開劑少量、定量使用，以足夠展層一次的用量為宜。

(2)每一種溶劑在展開中都有其一定的作用：a.展開劑中比例較大的溶劑起溶解物質(zhì)和基本分離的作用，極性相對(duì)較?。篵.展開劑中比例較小的溶劑,極性較大，對(duì)被分離物質(zhì)有較強(qiáng)的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動(dòng)，可以增大Rf值，但不能提高分辨率；c.展開劑中加入少量酸、堿可抑制某些化合物的斑點(diǎn)拖尾；比如：六味地黃丸測(cè)定山茱萸中的熊果酸，展開劑是：環(huán)己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20：5：8：0.1）d.展開劑中加入丙酮等中等極性溶劑可使不相混合的溶劑混溶，并可以降低展開粘度，加快展速。6、展距:一般為8-15cm

在這種展距內(nèi)得不到分離的組分,增加展距并非解決問(wèn)題的辦法,不僅延長(zhǎng)了分離的時(shí)間,而且會(huì)引起斑點(diǎn)擴(kuò)散反而降低分離度,因此,展距內(nèi)分離不理想時(shí),不能一味的增加展距,而是可以優(yōu)化展開劑,以得到理想的結(jié)果。

由此可見(jiàn),展開時(shí)必須控制條件一致，得到重現(xiàn)的分辨率最佳的色譜，才能得到可靠的定性定量結(jié)果。（四）顯色

顯色劑必須與樣品定量反應(yīng),且靈敏度要高,專屬性要強(qiáng),色點(diǎn)穩(wěn)定性好。

常用的是噴霧法顯色,分為自動(dòng)噴霧、手動(dòng)噴霧。自動(dòng)噴霧的霧滴均勻而細(xì),比手動(dòng)噴霧得到的背景吸收小,重現(xiàn)性及定量準(zhǔn)確度高。需注意的是：噴完顯色劑后,需加熱顯色的,應(yīng)注意控制加熱的溫度和時(shí)間，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，溫度過(guò)高或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易焦化，如果用硫酸等顯色劑可使板面炭化而影響顯色效果；加熱時(shí)間不夠，導(dǎo)致斑點(diǎn)未顯出或顯色不完全；有的成分加熱的溫度和加熱的時(shí)間不同.顯色效果是有差別的。

將顯色的薄層板避光保存，以同樣大小的玻璃板覆蓋并密封，可增加色斑的穩(wěn)定性。（五）薄層掃描定量（1）色譜條件不優(yōu)化，操作技術(shù)不規(guī)范得到的色譜很差，就不可能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。（2）輸入薄層掃描儀的參數(shù)不合理也會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性，掃描方向應(yīng)保持一致，應(yīng)沿展開方向掃描,不宜垂直于展開方向掃描。

總之，要得到理想的色譜分離及準(zhǔn)確的定量結(jié)果，色譜條件的標(biāo)準(zhǔn)化，操作技術(shù)的規(guī)范化是十分重要的。三、介紹CAMAG薄層掃描儀

1、基本原理日本島津生產(chǎn)的CS系列儀器瑞士CAMAG公司的薄層掃描儀基本原理：就是用一束長(zhǎng)寬可以調(diào)節(jié)的一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個(gè)斑點(diǎn)的掃描，用儀器測(cè)量通過(guò)斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束強(qiáng)度的變化達(dá)到定量的目的。2、基本用途

（1）定性—光譜測(cè)定在波長(zhǎng)200-800nm之間進(jìn)行斑點(diǎn)原位掃描，測(cè)得該化合物的吸收曲線及最大吸收，并與對(duì)照品比較從而對(duì)樣品中該成分進(jìn)一步確證。CAMAG公司的WINCATS軟件有斑點(diǎn)光譜圖的儲(chǔ)存功能，因此可對(duì)斑點(diǎn)光譜進(jìn)行檢索，可隨時(shí)與分析樣品或標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。（2）定量—色譜測(cè)定，前面已經(jīng)介紹了定量方法：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等。3、CAMAG薄層掃描的組成部分

（1）半自動(dòng)點(diǎn)樣儀：注意：樣品溶液應(yīng)澄清，防止溶液中的沉淀堵塞點(diǎn)樣針。（2）數(shù)碼照相系統(tǒng)暗箱:可見(jiàn)光、254nm紫外光、及365nm紫外光光源。注意：薄層照相前應(yīng)揮干溶劑，防止溶劑污染,腐蝕儀器。(3)薄層掃描儀(1)由光源、單色器、薄層板臺(tái)、檢測(cè)器、WINCATS工作站組成。(2)光源：鎢燈：可見(jiàn)光區(qū)370-800nm

氘燈：紫外區(qū)190-450nm

汞燈：220-650nm注意：（1）儀器使用過(guò)程中，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)行掃描（約2小時(shí)），應(yīng)把儀器內(nèi)部的三個(gè)光源燈（D2，W，Hg）通過(guò)手動(dòng)控制面板熄滅