細胞表面分子的檢測與分析

本次實驗課流程課件講述40min實驗演示20min流式細胞儀硬件及軟件介紹30min上機檢測40min解惑答疑15min流式樣本制備武漢大學醫(yī)學研究中心柳衛(wèi)凰流式在細胞表面分子檢測中的應(yīng)用免疫細胞及其亞群的檢測與功能分析例如：T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞等血液系統(tǒng)細胞表面標志的研究例如：急性白血病的初步診斷與檢測、CD34+造血干細胞研究、 血小板分析輔助診斷相關(guān)疾病等細胞群體及細胞表面標志變化的監(jiān)測例如：測定因試驗或臨床治療引起的某些細胞表面標志的變化細胞表面標志構(gòu)成性質(zhì)的分析例如：蛋白、糖蛋白、類脂結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、比例的分析標本來源實體組織新鮮組織、石蠟包埋樣本骨髓穿刺液

體液、灌洗液外周血全血溶血、PBMC培養(yǎng)的細胞

原代細胞細胞系：貼壁細胞、懸浮細胞

一、新鮮實體組織樣本的制備酶消化法。常用的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等機械法。1、剪碎法2、網(wǎng)搓法3、研磨法化學處理法。常用試劑：0.2%EDTA0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化過程外，其余步驟最好在4℃環(huán)境下操作，提高細胞活性。標本制備

標本制備二、全血標本的制備

“ABC”溶血（Beckman）取肝素鈉抗凝的外周血100ul，熒光標記完成后，依次加入A液600ul，輕輕振蕩15s；B液260ul,輕輕振蕩15s；C液100ul,振蕩10s，免洗上機檢測。

“ACK”溶血（自配）

以1：3的比例取肝素鈉抗凝的外周血與ACK溶血劑混勻，室溫放置10min，離心去上清，再加入溶血劑溶血，反復2～3次，至紅細胞完全溶解。細胞重懸后，再進行熒光標記。標本制備三、外周血單個核細胞的制備（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋成4ml，混勻；（2）將裝有4ml淋巴細胞分離液的試管傾斜45度，沿試管壁緩慢加入稀釋血液，勿用力過大；（3）離心2000r/min，20min，離心后分層，上層為血漿層，中層為分離液層，底層為紅細胞層；（4）用吸管將上層與中層之間的單個核細胞層吸出，用生理鹽水洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標記。四、貼壁細胞單細胞懸液的制備（1）將培養(yǎng)細胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分鐘，至光鏡下見到貼壁細胞變圓還沒有漂浮為止，棄消化液，加PBS；（2）用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，移入離心管中；（3）離心，1000r/min，5min；（4）加PBS洗兩遍；（5）PBS重懸，將細胞吹打均勻；（6）熒光標記。標本制備標記方法直接免疫熒光法

特點：操作簡單、省時；特異性強；結(jié)果判斷較簡單。間接免疫熒光法

特點：適用范圍廣；抗體相對便宜；操作費時；易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果不易判斷。（建議只用于單標檢測）直接、間接混合染色法

染色原則：一般情況下先間接后直接，特殊情況下可先直接標記。推薦！對照設(shè)置陰性對照調(diào)節(jié)熒光探測器放大倍數(shù)，確定帶測標本的基礎(chǔ)熒光域值。常用的有：同型對照、封閉抗體對照、陰性細胞對照陽性對照檢測抗體特異性或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準確性?？瞻讓φ?/p>

確定待測標本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測染色方法是否成功。補償對照

多色熒光標記時，用于熒光光譜重疊的調(diào)節(jié)。同型對照（IsotypeControl）用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度⑤由未免疫動物血清純化而來雙色標記熒光補償口訣：橫平豎直熒光補償對照分析類型管功能加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5注意事項樣本的采集、儲存樣本的染色全血樣本的溶血效果流式實驗對照的設(shè)置樣本的采集手術(shù)切除的新鮮標本取材時，要避免出血或組織壞死。深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，造成檢測結(jié)果的誤差。采集靜脈血樣本時，要避免發(fā)生溶血。收集培養(yǎng)的細胞時，要注意選擇消化的方法和試劑。樣本的儲存原則：時間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫≦72小時EDTA抗凝的標本：室溫≦

24小時ACD抗凝的外周血：室溫≦

72小時ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細胞、血小板功能檢測：即刻檢測單核細胞表面抗原分析：≦1小時，4℃嗜酸性粒細胞表面抗原分析：≦24小時，4℃淋巴細胞免疫表型與DNA含量的分析：≦72小時樣本的染色影響抗原抗體反應(yīng)的因素

電解質(zhì)、反應(yīng)溫度與時間、PH值（7.2～7.4）流式抗體的選擇

根據(jù)流式細胞儀的類型選擇抗體抗體應(yīng)用級別、滴度和使用量的選擇根據(jù)抗原表達量選擇抗體溶血，即裂解紅細胞。它是流式細胞術(shù)分析白細胞的先決條件。溶血不好，白細胞群不能很好分開，溶血好壞直接影響檢測結(jié)果。因此，必須對溶血過程進行嚴格控制。

全血樣本：溶血效果很重要影響溶血的因素：采血過程溶血劑的使用實驗操作過程結(jié)語流式細胞術(shù)的樣本制備沒有一個黃金標準最佳樣本制備方法需要根據(jù)具體情況獨立設(shè)定評估常用的熒光染料熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色

FITC488525免疫熒光綠色

PE(RD1)488575免疫熒光橙色

ECD488620免疫熒光橙紅

PeCy5488675免疫熒光紅

PI488620DNA染色橙紅

PECy7 488 755 免疫熒光深紅

PerCP 488 670免疫熒光深紅參考書籍《實用流式細胞術(shù)彩色圖譜》王書奎主編《流式細胞術(shù)基本原理與實用技術(shù)》梁智輝主編《臨床流式細胞分析》王建中主編《流式細胞術(shù)》杜立穎主編實驗：人外周血T淋巴細胞亞群的

檢測與分析淋巴細胞單核細胞粒細胞這三群細胞分別由具有不同功能的細胞組成這些細胞數(shù)量不等，甚至非常稀少這些細胞表達不同的標記物，是用來區(qū)分它們的基礎(chǔ)T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細胞,其表達/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞當免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高感染時升高活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞NK細胞CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆

實驗分組

同型對照管或空白對照(調(diào)節(jié)電壓)

單標補償管(電壓不變,調(diào)節(jié)熒光補償)

雙標樣本檢測管1.取4只FCM測量管，編號blank、CD3、CD4、CD3\CD4，各管內(nèi)加入100μl新鮮抗凝血；2.直接標記法：各管內(nèi)加入相應(yīng)的熒光標記抗人的單克隆抗體2ul，充分混勻，閉光孵育20～30min；3.溶血。ACK溶血劑:加入500μl

ACK溶血劑，充分混勻，反應(yīng)10min,1500r/min離心5min，去上清，PBS洗1次；若紅細胞存留較多，再重復溶血一遍。收集細胞上機檢測。實驗步驟ABC溶血劑配方A:0.12%甲酸(超純水配置)B:碳酸鈉6.0g/L;氯化鈉14.5g/L;

硫酸鈉31.3g/L(超純水配置)C:多聚甲醛10.0g/L(PBS配置)ACK溶血劑配方150mM(8.025g)

NH4Cl

10mM

(1.01g)

KHCO30.1mM

(0.0372g)

Na2EDTA調(diào)PH至7.2-7.4，定容至1000ml無菌濾膜濾過，4℃保存熒光補償“A門”內(nèi)CD3/CD4的表達“A門”位置變化引起的改變“A門”位置變化引起的改變小鼠脾細胞CD3+/CD4+的表達流式檢測胞內(nèi)細胞因子步驟

1、肝素鈉抗凝血1ml+1ml不完全1640培養(yǎng)液混勻，鋪24孔板1孔。2、PMA（終濃度100ng/ml）+Ionomycin（終濃度1μg/ml），37℃5%CO2刺激2h。3、2h后加入阻斷劑Monensin（終濃度2.5μmol/ml）混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4、培養(yǎng)結(jié)束后，1500rpm*5min離心去上清。5、表面分子染色。取7只流式檢測試管，每管中加入100μl壓積血，按下列表格內(nèi)容加入抗體染色，4℃避光染色30min。管號檢測內(nèi)容熒光抗體1空白對照無2熒光補償管FITC-CD35μl3熒光補償管PE-CD85μl4熒光補償管Pecy5-CD85μl5熒光補償管APC-CD35μl6同型對照APC-CD3;Pecy5-CD87測試管APC-CD3;Pecy5-CD86、溶血。各管內(nèi)加入1mlBD溶血劑，混勻，室溫避光靜置10min，1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗一次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細胞。7、固定。各管內(nèi)加入500μl2%PFA固定劑，4℃避光固定30min。1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗兩次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細胞。8、透膜。各管內(nèi)加入500μl透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min離心去上清。9、封閉。6、7號管加入25μl封閉液。（5μl小鼠血清+20μl10%BSA)4℃避光30min。10、胞內(nèi)染色。6號管內(nèi)加入同型對照抗體FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2μl；7號管內(nèi)加入抗體FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色緩沖液1ml/管再洗一次。11、上機檢測。2%PFA固定劑300μl/管混勻重懸4℃放置待檢。流式檢測外周血Treg細胞步驟1、采集靜脈血2ml于肝素鈉抗凝管內(nèi)。2、表面分子染色。取7只流式檢測試管，每管中加入100μl抗凝血，按下列表格內(nèi)容加入抗體染色，4℃避光染色30min。

管號檢測內(nèi)容熒光抗體1空白對照無2熒光補償管FITC-CD45μl3熒光補償管PE-CD45μl4熒光補償管Pecy5-CD35μl5熒光補償管APC-CD35μl6同型對照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-mIgG17胞內(nèi)同型對照Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD258測試管Pecy5-CD3;FITC-CD4;PE-CD253、溶血。各管內(nèi)加入1mlBD溶血劑，混勻，室溫避光靜置10min，1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗一次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細胞。4、固定。各管