分光光度技術(shù)3-4

第二章

分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)

分光光度技術(shù)(分光光度法)主要是指利用物質(zhì)特有的光譜來(lái)鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù)，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的發(fā)展:比色法只限于在可見光區(qū)，分光光度法則可以擴(kuò)展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。比色法用的單色光是來(lái)自濾光片，譜帶寬度從40－120nm，精度不高，分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3－5nm，在紫外區(qū)可到1nm以下，來(lái)自棱鏡或光柵，具有較高的精度。分光光度技術(shù)基本原理

分光光度計(jì)

基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用

分光光度法的誤差

分光光度技術(shù)基本原理一、光的基本知識(shí)

光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒性和連續(xù)的波動(dòng)性。波長(zhǎng)和頻率是光的波動(dòng)性的特征，可用下式表示：

Ｃ

λ＝───

Ｖ

式中λ為波長(zhǎng)，具有相同的振動(dòng)相位的相鄰兩點(diǎn)間的距離叫波長(zhǎng)。Ｖ為頻率，即每秒鐘振動(dòng)次數(shù)。Ｃ為光速等于299770千米／秒。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長(zhǎng)的電磁波，分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之間。其中200nm－400nm為紫外光區(qū)，400nm－760nm為可見光區(qū)，760nm－10,000nm為紅外光區(qū)。自然界的電磁波譜

自然界的電磁波譜①γ射線(γ-ray)它是放射性物質(zhì)發(fā)出的電磁波,波長(zhǎng)在2×10-10m以下。是一種能量很大的光子流。在醫(yī)療上用γ射線作為“手術(shù)刀”來(lái)切除腫瘤,叫做γ刀,有很好的治療效果。②X射線(X-ray)它是由X射線管產(chǎn)生的電磁波，波長(zhǎng)在10-15~10-7m，X射線對(duì)不同密度的物質(zhì)有不同的穿透力。在醫(yī)學(xué)上常用作醫(yī)療檢查。在飛機(jī)場(chǎng)安全檢查中，也常用X射線對(duì)行李進(jìn)行透視查驗(yàn)。自然界的電磁波譜③紫外線(ultravioletray)當(dāng)光電流通過兩電極間的電離氣體時(shí)，會(huì)產(chǎn)生紫外線。其波長(zhǎng)在4×10-8~4×10-7m。太陽(yáng)光中含有紫外線。紫外線能激發(fā)熒光，日光燈就是管內(nèi)紫外線激發(fā)涂在燈管內(nèi)壁上的熒光粉而發(fā)出的近似日光光譜的照明燈。紫外線也常用在醫(yī)學(xué)上殺菌和防偽技術(shù)上。自然界的電磁波譜④可見光(visiblelight)它是能引起人的視覺感覺的電磁波，其波長(zhǎng)范圍是0.4×10-6~0.8×10-6m。太陽(yáng)能發(fā)出可見光。可見光是由不同比例的七色光(紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫)所混合組成。⑤紅外線(infraredray)通常情況下由灼熱物體發(fā)出的電磁波，其波長(zhǎng)范圍是0.8×10-6~1×10-3m。它們會(huì)導(dǎo)致物體溫度的升高。紅外電磁波在特定的紅外敏感膠片上能形成熱成像。自然界的電磁波譜⑥微波(microwave)——常用于雷達(dá)設(shè)備上的波長(zhǎng)很短的無(wú)線電波，其波長(zhǎng)范圍在1×10-3~1m。由于微波的定向性好，常用發(fā)射、反射波的時(shí)間來(lái)測(cè)算目標(biāo)的位置。微波爐是一種用微波的熱效應(yīng)來(lái)烹調(diào)食品的裝置。⑦無(wú)線電波(radiowave)它是在電磁場(chǎng)的作用下無(wú)線電天線中自由電子發(fā)生振蕩而產(chǎn)生的電磁波。波長(zhǎng)范圍在0.75×10-3~1×104m。分光光度技術(shù)基本原理朗伯－比爾（Lambert-Beer）定律

吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比.A＝－lgT＝KLCA——吸光度，又稱光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I。-為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I-為透過吸收池的光強(qiáng)。k——摩爾吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）。L——樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，L=1cm。C-——樣品濃度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“k”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。分光光度技術(shù)基本原理吸光系數(shù)K取決于入射光的波長(zhǎng)，溶液的性質(zhì)和溫度等，而與光的強(qiáng)度、溶液的濃度及液層的厚度無(wú)關(guān)。在一定波長(zhǎng)下，它是物質(zhì)的特性常數(shù)。不同物質(zhì)可能有相同的最大吸收波長(zhǎng)，但其吸光系數(shù)不一定相同。K值愈大，說明該物質(zhì)溶液對(duì)光吸收愈強(qiáng)烈，則比色測(cè)定的靈敏度愈高。分光光度技術(shù)基本原理吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：A＝k1L1C1＋k2L2C2＋k3L3C3＋……即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

能從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來(lái)并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器稱為分光光度計(jì)。分光光度計(jì)因使用的波長(zhǎng)范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬(wàn)用（全波段）分光光度計(jì)等。無(wú)論哪一類分光光度計(jì)都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測(cè)器系統(tǒng)。

基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介----光源

光源要求能提供所需波長(zhǎng)范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強(qiáng)度。常用的有白熾燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。鎢燈和鹵鎢燈發(fā)射320－2000nm連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為360－1000nm，穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度計(jì)的光源。氫燈和氘燈能發(fā)射150－400nm的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計(jì)的光源。汞燈發(fā)射的不是連續(xù)光譜，能量絕大部分集中在253.6nm波長(zhǎng)外，一般作波長(zhǎng)校正用。鎢燈在出現(xiàn)燈管發(fā)黑時(shí)應(yīng)及更換，如換用的燈型號(hào)不同，還需要調(diào)節(jié)燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發(fā)射方向，安裝時(shí)必須仔細(xì)校正接觸燈管時(shí)應(yīng)戴手套以防留下污跡?；窘Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

----單色器分光系統(tǒng)（單色器）

單色器是指能從混合光波中分解出來(lái)所需單一波長(zhǎng)光的裝置，由棱鏡或光柵構(gòu)成。用玻璃制成的棱鏡色散力強(qiáng)，但只能在可見光區(qū)工作，石英棱鏡工作波長(zhǎng)范圍為185---4000nm，在紫外區(qū)有較好的分辯力而且也適用于可見光區(qū)和近紅外區(qū)。棱鏡的特點(diǎn)是波長(zhǎng)越短，色散程度越好，越向長(zhǎng)波一側(cè)越差。所以用棱鏡的分光光度計(jì)，其波長(zhǎng)刻度在紫外區(qū)可達(dá)到0.2nm，而在長(zhǎng)波段只能達(dá)到5nm。有的分光光系統(tǒng)是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，較長(zhǎng)的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介----狹縫、樣品池狹縫

狹縫是指由一對(duì)隔板在光通路上形成的縫隙，用來(lái)調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強(qiáng)度，也直接影響分辯力。狹縫可在0－2mm寬度內(nèi)調(diào)節(jié)，由于棱鏡色散力隨波長(zhǎng)不同而變化，較先進(jìn)的分光光度計(jì)的狹縫寬度可隨波長(zhǎng)一起調(diào)節(jié)。比色杯

比爭(zhēng)杯也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來(lái)盛溶液，各個(gè)杯子壁厚度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測(cè)定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測(cè)定時(shí)要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈?；窘Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介----檢測(cè)系統(tǒng)

有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強(qiáng)電流愈大，此即光電效應(yīng)。因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流頗大，可直接用微電流計(jì)量出。但是，當(dāng)連續(xù)照射一段時(shí)間會(huì)產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一些時(shí)候才能恢復(fù)。因此使用時(shí)不宜長(zhǎng)期照射，隨用隨關(guān)，以防止光電池因疲勞而產(chǎn)生誤差。

基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介----檢測(cè)系統(tǒng)光電管裝有一個(gè)陰極和一個(gè)陽(yáng)極，陰極是用對(duì)光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物）做成，當(dāng)光射到陰極且達(dá)到一定能量時(shí)，金屬原子中電子發(fā)射出來(lái)。光愈強(qiáng)，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負(fù)電的，被吸引到陽(yáng)極上而產(chǎn)生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，需要放大。分光光度計(jì)中常用電子倍增光電管，在光照射下所產(chǎn)生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測(cè)定的靈敏度?；窘Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介----檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計(jì)算機(jī)聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬／數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。721型可見分光光度計(jì)工作波長(zhǎng)：340-1000nm721系列可見分光光度計(jì)工作波長(zhǎng)：340-1000nm721系列可見分光光度計(jì)（掃描型）配置：簡(jiǎn)，操作軟件、定量分析、時(shí)間掃描，可選配打印機(jī)、計(jì)算機(jī)751型紫外可見分光光度計(jì)工作波長(zhǎng)：200-1000nm755PC型紫外可見分光光度計(jì)標(biāo)配：操作軟件、定量分析、時(shí)間掃描、光譜掃描，可選配打印機(jī)、計(jì)算機(jī)UNICO-2102紫外可見分光光度計(jì)工作波長(zhǎng)：200-1000nm分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量單一物質(zhì)的定量分析先測(cè)出其吸收光譜曲線，找出最大吸收波長(zhǎng)。含量測(cè)定時(shí)所用波長(zhǎng)通常要選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，這樣做有兩個(gè)好處：⑴靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；⑵可以避免其它物質(zhì)的干擾?？梢娀蜃贤夥止夤舛确ǘ伎捎糜跍y(cè)定溶液中物質(zhì)的含量。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測(cè)定的溶液）的吸光度，進(jìn)行比較，由于所用吸收池的厚度是一樣的。也可以先測(cè)出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線，然后測(cè)定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對(duì)應(yīng)的濃度。

分光光度計(jì)的應(yīng)用----定量分析混合樣品的定量分析吸收光譜不重疊的混合物定量方法-----互不干擾分別測(cè)定吸收光譜重疊的混合物定量方法采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以克服光譜定量分析中出現(xiàn)的多重共線性、光譜重疊和組分的相互干擾等問題,并且不需分離可直接同時(shí)測(cè)定混合體系的各組分。因此發(fā)展了如主成分回歸(PCR)、小波包變換、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)以及遺傳算法等多種線性或非線性的多元校準(zhǔn)方法,波長(zhǎng)選擇是光譜分析中各種多元校準(zhǔn)方法的關(guān)鍵步驟。

分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用定性鑒定用紫外光譜鑒定化合物

使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長(zhǎng)不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測(cè)定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度，然后以波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)繪制吸光度──波長(zhǎng)曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進(jìn)行物質(zhì)種類的鑒定。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用一定物質(zhì)在不同濃度時(shí)，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長(zhǎng)是一定不變的。當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線一樣時(shí)，則很可能它們是同一物質(zhì)。紫外線吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物表現(xiàn)出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡(jiǎn)單，同一種物質(zhì)的紫外吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨(dú)依靠紫外吸收光譜決定一個(gè)未知物結(jié)構(gòu)，必須與其它方法配合。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用結(jié)構(gòu)分析作為結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜遠(yuǎn)不及紅外吸收光譜重要可靠，因?yàn)樽贤馕展庾V曲線的特征性不及紅外光譜曲線，紅外光譜曲線屬‘指紋’型，而大多數(shù)有機(jī)化合物在紫外光區(qū)無(wú)吸收。利用紫外吸收光譜可鑒定化合物中具有共軛系統(tǒng)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用在生化分析領(lǐng)域主要用于氨基酸含量的測(cè)定、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定、核酸的測(cè)定、酶活力測(cè)定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究等。分光光度計(jì)的誤差濃度過高或過低的樣品，易引起檢測(cè)器標(biāo)尺上的讀數(shù)誤差。從理論上推算，相對(duì)誤差最小的部分在透光度為36.8%處（或吸光度為0.4343處），故通常認(rèn)為測(cè)定值在吸光度0.20-0.80范圍內(nèi)（透光度為20%—65%）誤差最小，超出此范圍，相對(duì)誤差均會(huì)增大。分光光度計(jì)的誤差影響分光光度計(jì)精確度的主要原因還有光譜純度。一般應(yīng)保持光譜帶寬度在10nm以下，如果測(cè)定樣品中有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計(jì)均有可調(diào)的狹縫。在實(shí)際應(yīng)用中，用較大的狹縫雖然可提高重現(xiàn)性，但加大光譜寬度反而減低了準(zhǔn)確度。原則為：在保證測(cè)定的情況下，應(yīng)用較低的狹縫分光光度計(jì)的誤差散射光也是引起誤差的重要因素。散射光指一切未經(jīng)過測(cè)定溶液吸收，而又落到檢測(cè)器上引起干擾的光，如室內(nèi)自然光，也包括能透過比色皿的非測(cè)定需要的其它波長(zhǎng)的光。

散射光干擾對(duì)高濃度測(cè)定特別有害，能使吸光度降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線的高濃部分向下彎曲。

使用原則：分光光度計(jì)宜安裝在光線較暗的室內(nèi)。

熒光分析法光致發(fā)光：物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)所吸收的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。我們通常所說的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光后發(fā)出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紫外熒光或可見熒光，以及吸收波長(zhǎng)較短的可見光后發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見熒光。除了紫外熒光和可見熒光，還有紅外熒光、X射線熒光等

熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。特點(diǎn)：1）靈敏度高2）選擇性好3）方法簡(jiǎn)單快速，用樣量少4）應(yīng)用受限熒光分析法的基本原理一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜二、熒光與分子結(jié)構(gòu)三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程

基態(tài)+hv→激發(fā)態(tài)光譜中電子能級(jí)可分為二組：1）電子自旋配對(duì)的（電子自旋方向相反，電子的凈自旋S=0，譜線多重性M=2S+1=1）稱為單重態(tài)或單線態(tài)，以S表示。2）電子自旋非配對(duì)的（電子自旋方向相同，其凈自旋S=1，譜線多重性M=3）稱為三重態(tài)或三線態(tài)，以T表示。

激發(fā)單重態(tài)與相應(yīng)的三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同及三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。三重態(tài)壽命較長(zhǎng)。2、熒光的產(chǎn)生基態(tài)光輻射激發(fā)態(tài)基態(tài)釋放能量振動(dòng)弛豫（vibrational

relexation）處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰撞，能量傳遞給溶劑分子，電子返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

特點(diǎn)：無(wú)輻射躍遷；只能在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行；時(shí)間約為10-12s；使大多數(shù)電子激發(fā)態(tài)處于其最低振動(dòng)能級(jí)上。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internalconversion）：內(nèi)轉(zhuǎn)換兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無(wú)輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程。

特點(diǎn)：無(wú)輻射躍遷；兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)具有相同的多重性（都是單重態(tài)或都是三重態(tài)，如S2*→S1*，T2*→T1*）。處于激發(fā)單重態(tài)的分子通過振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

熒光發(fā)射處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上，發(fā)射的光量子稱為熒光。

特點(diǎn)：

1）發(fā)射光量子，且熒光波長(zhǎng)總是長(zhǎng)于激發(fā)光波長(zhǎng)；

2）時(shí)間約為10-9-10-7s；

3）熒光譜線有時(shí)呈現(xiàn)幾個(gè)非常接近的峰（電子返回到基態(tài)不能振動(dòng)能級(jí)，能級(jí)差不同，吸收波長(zhǎng)不同）；

4）處于基態(tài)不同能級(jí)的電子會(huì)通過振動(dòng)弛豫返回到基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)。（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（excitationspectrum）：不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。繪制：固定發(fā)射波長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)（λex）的關(guān)系曲線，其形狀與吸收光譜相似。熒光光譜（fluorescencespectrum）：在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制：固定激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)（λem）的關(guān)系曲線。熒光分析法通常采用λexmax與λemmax。（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時(shí)具備兩個(gè)條件：

1）有強(qiáng)的紫外-可見吸收

2）有一定的熒光效率

長(zhǎng)共軛分子→較強(qiáng)紫外吸收

剛性平面結(jié)構(gòu)分子→較高熒光效率{1、長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)具有π→π*躍遷大多數(shù)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，π電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度越大，熒光波長(zhǎng)也長(zhǎng)移。2、分子的剛性-共平面性分子剛性-共平面性越強(qiáng)，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)越長(zhǎng)。3、取代基

1）給電子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等，能增加分子的π電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。

2）吸電子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，減弱分子的π電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅。

3）取代基對(duì)π電子共軛體系作用較小，如-R、-SO3H、-NH3+等，對(duì)熒光影響也不明顯。熒光探針分子的幾個(gè)基本要求

（1）能產(chǎn)生穩(wěn)定的，較強(qiáng)的熒光。（2）探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的結(jié)合，而且結(jié)合得比較牢固。（3）探針的熒光必須對(duì)環(huán)境條件較敏感。（4）結(jié)合的探針不應(yīng)影響被研究的大分子的結(jié)構(gòu)和特性。（三）熒光試劑弱/無(wú)熒光物質(zhì)+熒光試劑→強(qiáng)熒光產(chǎn)物1、熒光胺（fluorescamine）：特點(diǎn)：與脂肪族和芳香族伯胺形成高度熒光衍生物。熒光胺及其水解產(chǎn)物均不顯熒光。熒光條件：λex=275/390nm，λem=480nm。

2、鄰苯二甲醛（OPA）：特點(diǎn)：在2-巰基乙醇存在下，pH9-10的緩沖溶液中能與伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的α-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。熒光條件：λex=340nm，λem=455nm。例：測(cè)定磺胺類藥物3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，DANS-Cl，丹酰氯）：

與伯、仲胺及酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。丹酰肼（Dansyl-NHNH2）：與可的松等的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件：λex=365nm，λem=500nm?！坊幬锏臏y(cè)定雌激素的測(cè)定→4、測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑無(wú)機(jī)離子+有機(jī)化合物→配合物→直接測(cè)定熒光強(qiáng)度加入無(wú)機(jī)離子（如CN-、F-等）配合物熒光減弱或消失熒光猝滅法三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度：溫度↑→熒光效率↓，熒光強(qiáng)度↓原因：溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無(wú)輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。2、溶劑：

1）溶劑極性：極性↑→熒光波長(zhǎng)↑，熒光強(qiáng)度↑原因：極性溶劑中，π→π*躍遷能量差ΔE小，使紫外吸收波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)均長(zhǎng)移；躍遷幾率增加，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2）溶劑粘度：粘度↓→熒光強(qiáng)度↓原因：溶劑粘度低，分子間碰撞機(jī)會(huì)增加，使無(wú)輻射躍遷增加，使熒光減弱。溫度↑→溶劑粘度↓→熒光強(qiáng)度↓3、酸度：熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)其熒光強(qiáng)度有較大影響，因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，因此熒光強(qiáng)度也有差異。如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，發(fā)生藍(lán)色熒光；pH<2或pH>13的溶液中均以離子形式存在，不發(fā)射熒光。

4、熒光熄滅劑：熒光熄滅：熒光猝滅，指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。作用機(jī)制：

1）熒光物質(zhì)分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；

2）熒光物質(zhì)分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；

3）溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)體系間跨越，激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；

4）濃度較大（超過1g/L）時(shí)，發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法（fluorescencequenchingmethod）：熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，利用這一性質(zhì)測(cè)定熒光熄滅劑的含量的方法。熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系溶液的熒光強(qiáng)度在樣品濃度較低時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但到了一定濃度以后，就不再存在這種正比關(guān)系。在較濃的溶液中，熒光強(qiáng)度并不隨溶液濃度呈正比增長(zhǎng)。因此，必須找出與熒光強(qiáng)度呈線性的濃度范圍。

熒光物質(zhì)濃度過大時(shí)，常常發(fā)生猝滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強(qiáng)度反而大大低于接近飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。對(duì)濃度猝滅產(chǎn)生的原因，最簡(jiǎn)單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自猝滅。濃度過高，還可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降低熒光強(qiáng)度。

條件：極稀溶液

二、定量分析方法1、校正曲線法：以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)。2、比例法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣熒光強(qiáng)度，對(duì)比。3、聯(lián)立方程式法：用于多組分混合物的熒光分析。

熒光分光光度計(jì)

和熒光分析新技術(shù)一、熒光分光光度計(jì)濾光片熒光計(jì)：激發(fā)濾光片讓激發(fā)光通過；發(fā)射濾光片常用截止濾光片，截去所有的激發(fā)光和散射光，只允許試樣的熒光通過，不能測(cè)定光譜，只用于定量分析。濾光片-單色器熒光計(jì)：將發(fā)射濾光片用光柵代替，不能測(cè)定激發(fā)光譜，可測(cè)定熒光光譜。熒光分光光度計(jì)：兩個(gè)濾光片都用光柵取代，可繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。1、熒光分光光度計(jì)的主要部件：激發(fā)光源：氙燈、高壓汞燈、激光激發(fā)單色器（樣品池前）：光柵或?yàn)V光片發(fā)射單色器（樣品池后）：光柵或?yàn)V光片樣品池：石英檢測(cè)系統(tǒng)：光電倍增管2、儀器的校正（1）靈敏度校正：用被檢測(cè)出的最低信號(hào)來(lái)表示，或用某一對(duì)照品的稀溶液在一定激發(fā)波長(zhǎng)光的照射下，能發(fā)射出最低信噪比時(shí)的熒光強(qiáng)度的最低濃度表示。（2）波長(zhǎng)校正：用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長(zhǎng)刻度校正。（3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正二、熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介1、激光熒光分析光源：激光，單色性極好，強(qiáng)度更大。優(yōu)點(diǎn)：提高了熒光分析法的靈敏度和選擇性。2、時(shí)間分辨熒光分析：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩的時(shí)間不同，以實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。光源：脈沖激光。應(yīng)用：多用于臨床檢驗(yàn)，如乙肝病毒的檢測(cè)，甲狀腺功能檢測(cè)等。測(cè)定水中痕量釷的熒光時(shí)間分辨圖利用時(shí)間分辨熒光法消除鋁、鋯等的干擾從圖中可見，在12s內(nèi)測(cè)定熒光信號(hào)，可基本消除鋁、鋯的影響。

3、同步熒光分析（synchronousfluorometry）

原理：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長(zhǎng)差值Δλ（通常選用λexmax與λemmax之差），同時(shí)掃描發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)，得到同步熒光光譜。若Δλ值相當(dāng)于或大于斯托克斯位移，就能獲得尖而窄的同步熒光峰。熒光物質(zhì)濃度與同步熒光峰峰高呈線性關(guān)系，可用于定量分析。

優(yōu)點(diǎn)：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

同步光譜4、膠束增敏熒光分析

膠束溶液即濃度在臨界濃度以上的表面活性劑溶液，極性溶劑中，形成親水基向外、疏水基向內(nèi)的膠束。優(yōu)點(diǎn)：

1）極性較小而難溶于水的熒光物質(zhì)在膠束溶液中溶解顯著增加；

2）膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有增敏和增穩(wěn)作用。熒光分析在生物學(xué)中的應(yīng)用

（一）天然熒光物質(zhì)的應(yīng)用生物學(xué)中比較重要的天然熒光分子多屬具有共軛雙鍵的系統(tǒng)。如芳香氨基酸、核黃素、維生素A、卟啉、葉綠素、NADH和tRNA中的Y堿基（二氫尿嘧啶）等。對(duì)于含有這些天然熒光物質(zhì)的樣品，可以直接通達(dá)量測(cè)其熒光來(lái)確定其存在，分布及數(shù)量。1.蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光利用蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光檢測(cè)蛋白，其靈敏度高于紫外吸收法。蛋白質(zhì)的熒光來(lái)自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它們的相對(duì)熒光強(qiáng)度為100:9:0.5。檢測(cè)蛋白質(zhì)的天然熒光，可采用280nm的激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)范圍在300-350（蛋白溶液為中性時(shí)）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸(稱為A類蛋白質(zhì))，則熒光光譜主要表現(xiàn)酪氨酸的特征，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為304nm。對(duì)于含有色氨酸的蛋白(稱為B類蛋白質(zhì))，熒光光譜則主要表現(xiàn)色氨酸的特征，最大熒