第18章色譜法導論-32h

第18章色譜法導論第一節(jié)概論色譜法的最早應(yīng)用是用于分離植物色素，其方法是這樣的：在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。此時，玻璃管的上端立即出現(xiàn)幾種顏色的混合譜帶。然后用純石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不斷地向下移動，并逐漸分開成幾個不同顏色的譜帶，繼續(xù)沖洗就可分別接得各種顏色的色素，并可分別進行鑒定。色譜法也由此而得名。玻璃管為色譜柱，管內(nèi)的碳酸鈣填料為固定相，石油醚淋洗液為流動相?，F(xiàn)在的色譜法早已不局限于色素的分離，其方法也早已得到了極大的發(fā)展，但其分離的原理仍然是一樣的。色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，能夠分離性質(zhì)相近的多組分復雜混合物。將色譜法用于分析化學并配合適當?shù)臋z測手段，就成為色譜分析法。色譜法分類1.按固定相形態(tài)分類柱色譜：固定相裝在色譜柱內(nèi)。包括填充柱、整體柱、毛細管柱或開管柱。平面色譜：固定相呈平面狀。包括薄層色譜和紙色譜。色譜法液相色譜法氣相色譜法氣-液色譜法氣-固色譜法液-固色譜法液-液色譜法2.按兩相的物理形態(tài)、分離機理分類第二節(jié)基本概念色譜分離體系由兩部分組成：一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。當流動相以一定速率流經(jīng)色譜柱，試樣中各個組分在流動相和固定相之間進行連續(xù)多次分配。組分與固定相和流動相之間的作用力有差別，因而組分在兩相中分布常數(shù)不同。在固定相上吸附力大的，即分布常數(shù)大的，遷移數(shù)率慢，保留時間長；在固定相上吸附力小，即分布常數(shù)小的，遷移數(shù)率快。試樣中各組分同時進入色譜柱，但是在不同時間從色譜柱中洗出，實現(xiàn)分離?；旌辖M分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)試樣組分在色譜體系中運行的特點：1.差速遷移：混合物中不同組分的遷移速率不同差速遷移(保留值的大小)取決于組分與固定相、流動相作用力的差異2.分子分布離散：同種組分分子在遷移過程中分布空間擴展分子分布離散取決于同種分子運動速率的差異色譜分離要求：差異速率(保留值大)，分子分布離散(色譜區(qū)帶)窄。2.分布平衡色譜涉及溶質(zhì)在兩相中的分布平衡，平衡常數(shù)K稱為分布系數(shù)或分配系數(shù)K=cs/cmcs是溶質(zhì)在固定相的濃度，cm是溶質(zhì)在流動相中的濃度，K是溶質(zhì)在兩相中分布平衡性質(zhì)的度量，反映溶質(zhì)與固定相、流動相作用力差別。K只與固定相和溫度有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)。溫度、溶質(zhì)一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)。每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；組分的分配系數(shù)K越小，出峰越快；組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；3.色譜流動相流速穩(wěn)定的流動相流速是色譜系統(tǒng)正常運行的基本條件。流動相的流速通常有兩種表達方式體積流量FcmL/min，單位時間流過色譜柱的平均體積。Fc采用容器收集柱后一定時間內(nèi)流出流動相的體積進行測定。線速度cm/min，mm/min，單位時間內(nèi)流動相流經(jīng)色譜柱的長度由柱長L和死時間tM求出，=L/tM4.色譜圖分離試樣各組分依次進入柱后，由檢測器產(chǎn)生檢測信號，響應(yīng)信號大小對時間或流動相流出體積的關(guān)系曲線為色譜圖。色譜圖的橫坐標是時間或流動相體積，縱坐標是組分在流動相中濃度或檢測器響應(yīng)信號大小，色譜圖是色譜分析的主要技術(shù)資料，色譜包含的色譜信息1.說明試樣是否是單一純化和物。正常色譜條件下，如果色譜圖有一個以上色譜峰，說明試樣中有一個以上組分。色譜圖能夠提供試樣中的最低組分數(shù)。2.說明色譜柱效和分離情況，可定量計算出表征色譜柱效的理論塔板數(shù)、評價相鄰物質(zhì)對分離優(yōu)劣的分離度。3.提供各組分保留時間等色譜定性數(shù)據(jù)。4.給出個組分色譜峰高、峰面積等定量數(shù)據(jù)。色譜圖基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線?；€在穩(wěn)定的條件下應(yīng)是一條水平的直線。它的平直與否可反應(yīng)出實驗條件的穩(wěn)定情況。色譜峰高(h)：色譜峰頂點與基線的距離叫峰高。峰面積：色譜峰與峰底基線所圍成區(qū)域的面積叫峰面積。色譜峰區(qū)域?qū)挾龋荷V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法：標準差：峰高0.607倍處峰寬處的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354峰底寬W：色譜峰兩側(cè)拐點上切線與基線的交點間的距離。W=4。5.保留值保留值是試樣各組分在色譜柱或色譜體系中保留行為的度量，反映溶質(zhì)與色譜固定相作用力類型和大小，是色譜熱力學參數(shù)和定性依據(jù)。比移值Rf：溶質(zhì)通過色譜柱的平均線速度u與流動相平均線速度ux之比。溶質(zhì)分子在流動相中消耗的時間分數(shù)等于溶質(zhì)分子在流動相中分布的分子分數(shù)，這樣得到：nm和ns分別為溶質(zhì)在流動相和固定相的分子數(shù)或物質(zhì)的量。溶質(zhì)在流動相中消耗的時間越多，nm越大，ux越大，Rf也越大。如果溶質(zhì)在流動相中消耗時間分數(shù)為1，即溶質(zhì)一直在流動相中遷移，未在固定相中停留，ux=u，Rf=1。如果溶質(zhì)一直停留在固定相，譜帶不隨流動相遷移，則ux=0，Rf=0。通常，0<Rf<1死時間(tM)：不與固定相作用的物質(zhì)從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。由于該物質(zhì)不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。tM=L/u實際應(yīng)用中，采用與流動相性質(zhì)相近、不與固定相發(fā)生作用的物質(zhì)。氣相色譜一般用空氣，液相色譜用與流動相性質(zhì)相近的溶劑。保留時間tR：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間，tM=L/ux它包括組份隨流動相通過柱子的時間tM和組份在固定相中滯留的時間。調(diào)整保留時間tR?：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。tR?=tR-tM死體積VM：死時間內(nèi)流經(jīng)色譜柱的流動相的體積VM=tMFcFc為柱出口的載氣流速(mL/min)保留體積VR：保留時間內(nèi)流經(jīng)色譜柱的流動相體積VR=tRFc調(diào)整保留體積VR?：在調(diào)整保留時間內(nèi)流經(jīng)色譜柱的流動相體積VR?=tR?Fc=VR-VM保留因子k:溶質(zhì)分布在固定相和流動相的分子數(shù)或物質(zhì)的量之比ns和nm分別為溶質(zhì)在固定相和流動相的分子數(shù)或物質(zhì)的量cs和cM是溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度Vs和VM是色譜柱中固定相和流動相當體積k也等于組分的校正保留時間與死時間的比值k可通過實驗測得。由此也可知道，k可表示出組分在柱中停留時間的長短。k越大，停留時間也就越長。還可推導出幾種保留值與k的關(guān)系相對保留值對A、B兩組分的相對保留值，用下式表示：

=tRA/tRB=kA/kB=KA/KB對固定相的選擇具有實際意義。如果兩組分的K或k值相等，則=1，兩個組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。第三節(jié)溶質(zhì)分布譜帶展寬理想色譜過程指溶質(zhì)在兩相間物質(zhì)交換在熱力學上可逆，傳質(zhì)速率很高，瞬間實現(xiàn)平衡，同時忽略分子擴散。線性理想色譜：溶質(zhì)在兩相間分布呈線性，溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)遷移為理想狀態(tài)，可以用簡單的理論模型和數(shù)學方法求出溶質(zhì)濃度分布。線性非理想色譜：大部分分配色譜非線性理想色譜：液固吸附色譜非線性非理想色譜：氣固吸附色譜2.塔板理論塔板理論是描述色譜柱中組分在兩相間的分配狀況及評價色譜柱的分離效能的一種半經(jīng)驗式的理論。塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經(jīng)驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。塔板理論假定：1）色譜柱由內(nèi)徑一致，填充均勻的塔板組成，塔板高度H均相等。2）塔板之間不連續(xù)，且塔板之間無分子擴散。3）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同，組分在各塔板內(nèi)兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H。4）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)分布平衡塔板理論是把色譜柱假想為一個精餾塔，塔內(nèi)存在許多塔板，組分在每個塔板的氣相和液相間進行分配，達成一次分配平衡。然后隨著流動相按一個塔板、一個塔板的方式向前移動。經(jīng)過多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），從而使分配系數(shù)不同的組分彼此得到分離。分離過程如下圖所示為簡單起見，設(shè)色譜柱由5決塔板（n=5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號。r=0，1，2，3，4，5；某組分的分配比k=1。開始時，將單位質(zhì)量（即m=1）的該組分進入0號塔板上，然后將流動相以一個板體積（△V）一個板體積的脈沖形式進入色譜柱；此時組分將按下表所示在固定相和流動相進行分配：板號r載氣體積0123進樣mM0.5mS0.5△VmM0.250.25mS0.250.252△VmM0.1250.125+0.1250.125mS0.1250.125+0.1250.1253△VmM0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063mS0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣相和液相的總質(zhì)量）見下表：nr01234出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2740.2740.11880.0040.0320.0860.1960.2740.13390.0020.0180.0590.1410.2360.138100.0010.0100.0380.1000.1890.118

n

r01234出口1100.0050.0240.0690.1450.0951200.0020.0160.0460.1070.0731300.0010.0080.0300.0760.05414000.0040.0190.0530.03815000.0020.0120.0360.02816000.0010.0080.0240.018由表中可見，當n=5時，即5個塔板體積的流動相進入柱中時，組分就開始從柱口流出。并且呈現(xiàn)先小后大的情況。以上是當塔板數(shù)為5時的情況，出現(xiàn)的峰形不對稱，這是由于塔板數(shù)太少的原因。當塔板數(shù)大于50時，峰形就是對稱的。在實際色譜柱中，n值很大（約為106～109）。所以色譜峰一般為正態(tài)分布。理論塔板的計算公式：對于一個柱子下說，其理論塔板數(shù)n可由下式計算：式中：tR為某組分的保留時間，2Δt1/2為某組分色譜峰的半高寬度，W為色譜峰的峰底寬度。由式可見，柱子的理論塔板數(shù)與峰寬和保留時間有關(guān)。保留時間越大，峰越窄，理論塔板數(shù)就越多。柱效能也就越高。對于一個柱長固定為L的柱子，其理論塔板高度H為每一個塔板的高度，即組分在柱內(nèi)每達成一次分配平衡所需要的柱長叫理論塔板高度。它越小，也表示柱效能越高。單位柱長的理論塔板數(shù)n或板高H常用作色譜柱效的指標。在以上計算理論塔板數(shù)的式子中使用的是保留時間，它包括了死時間，它與組分在柱內(nèi)的分配無關(guān)，因此不能真正反映色譜柱的柱效。為此，引入了有效塔板數(shù)的概念。同理有效塔板高度為：理論塔板數(shù)(高度)和有效理論塔板數(shù)(高度)的關(guān)系：塔板理論的特點：(1)當色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。3.速率理論-范弟姆特方程式塔板理論是一個半經(jīng)驗性的理論。它定性的給出了板高的概念，但不能指出影響板高的因素。速率理論就是在塔板理論的基礎(chǔ)上，給出了影響塔板高度的因素：u為流動相線速度；A，B，C為常數(shù)，其中A—表示渦流擴散系數(shù)；B/u—分子擴散因數(shù)；Cu—傳質(zhì)因數(shù)（包括液相和固相傳質(zhì)阻力系數(shù)）；Cs和Cm分別為流動相和固定相傳質(zhì)項系數(shù)。該式從動力學角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數(shù)值的方法，都可降低H，從而提高柱效。1）渦流擴散項(A)在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性——同一組分運行路線長短不同——流出時間不同——峰形展寬。展寬程度以A表示：A=2dp其中dp—填充物平均直徑；—填充不規(guī)則因子。

可見，使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。流動方向2）縱向擴散項(B/u)縱向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進，“塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。其大小為B=2D—稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況；D—組分在流動相中的擴散系數(shù)(cm2/s)。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；分子量大的組分，Dg小，即B小,Dg

隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減?。涣鲃酉喾肿恿看?，Dg小，即B小，u增加，組份停留時間短，縱向擴散?。唬˙/u）對于液相色譜，因Dm較小，B項可勿略。球狀顆粒；大分子量流動相；適當增加流速；短柱；低溫。3）傳質(zhì)阻力項(Cu)因傳質(zhì)阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質(zhì)過程不完全相同。下面分別作討論。a）固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)：傳質(zhì)阻力項系數(shù)Cs是保留因子k的一個復雜函數(shù)，與固定液膜厚度df平方成正比，與固定相內(nèi)地擴散系數(shù)Ds成反比。q是一個由固定項顆粒形狀和孔結(jié)構(gòu)決定的結(jié)構(gòu)因子氣體流動相對傳質(zhì)項Cm也是保留因子k的一個復雜函數(shù)，正比于柱填料粒徑dp的平方，反比于溶質(zhì)在氣體流動相內(nèi)的擴散系數(shù)Dm。固定相傳質(zhì)阻力與液膜厚度df、保留因子k和擴散系數(shù)Ds等有關(guān)。降低固定相傳質(zhì)阻力的方法有：減小液膜厚度df

；采用分子量小的流動相，使Ds增加；增加柱溫，可增加Ds，但k值也減小，為保持合適Cs值，應(yīng)控制柱溫。流動相傳質(zhì)阻力包與填充物大小dp、擴散系數(shù)Dm、微孔大小及其數(shù)量等有關(guān)。降低流動相傳質(zhì)阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在固定相和流動相中的擴散系數(shù)D、適當降低線速度、短柱。影響柱效的變量1.流動相流速由方程H=A+B/u+Cu知道：當u一定時，僅在A、B、C較小時，H較小，柱效較高；反之則柱效較低，色譜峰將展寬。以u對H作圖，可得H-u曲線（如圖），從該曲線得到：板高，H(cm)HminA+B/u+CuCuAB/u渦流擴散項A與流速u無關(guān)；低流速區(qū)(u小)，B/u大，分子擴散項占主導，此時選擇分子量大的氣體如N2和Ar為載氣，可減小擴散，提高柱效；高流速區(qū)(u大)，Cu大，傳質(zhì)阻力項占主導，此時選擇分子量小的氣體如H2和He為載氣，可增加擴散系數(shù)，提高柱效；

LC的Hmin和uopt均比GC的小一個數(shù)量級，即在

LC中，較低流速可獲得較大的柱效。

曲線的最低點對應(yīng)最佳線速uopt()下的最小板高Hmin()；2.填料粒徑dp大小對板高的影響實驗表明，顆粒越細，板高越小，受線速影響越小。即在HPLC分析中采用細粒作固定相的理論根據(jù)！但顆粒細導致柱流速慢，當采用高壓技術(shù)，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。板高,H(cm)3.色譜柱溫溫度影響擴散系數(shù)Ds和Dm，從而影響分子擴散和傳質(zhì)速率。溫度變化對色譜過程分子擴散和傳質(zhì)的影響是矛盾的：柱溫升高，Ds和Dm升高，但k值也減小，要選擇合適的溫度。色譜分離中的四種典型情況①分離效果差，柱效低，選擇性（）低②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（）低；③完全分離，選擇性（）增加，柱效低，峰寬④完全分離，柱效高，選擇性（）好第四節(jié)基本分離方程1.分離度同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。其定義為：R越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。R=1.0時，分離程度達到96%,稱為基本分離。R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號保留時間t,min2.色譜分離方程R的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n(動力學)、選擇因子和保留因子k(熱力學)聯(lián)系起來。對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數(shù)K相差小，可合理假設(shè)k1k2=k，W1W2=W。因此可導出R與n、和k的關(guān)系有關(guān)分離方程的討論：1）分離度R與柱效的關(guān)系分離度R與理論塔板數(shù)N有關(guān)，即R受熱力學性質(zhì)的影響。由色譜方程可得：因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應(yīng)增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長更有效。理論塔板數(shù)N：2）分離度R與保留因子的關(guān)系越大，柱選擇性越好，對分離有利。的微小變化可引起R較大改變。如，當從1.01增加至1.10(增加9%)時，R則增加9倍(但>1.5,R增加不大)。改變的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相的性質(zhì)和組成。

3）分離度R分配比k的關(guān)系

k增加，分離度R增加，但當k>10，則R的增加不明顯。通常k在2~10之間。改變k的方法有：適當增加柱溫(GC)、改變流動相性質(zhì)和組成(LC)以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶劑(流動相)組成對色譜分離的影響(梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；改變組成使k最佳3.分析時間t分析時間通常指最后一個組分出峰的時間。其值為可見，分析時間與R，，k、H/u等參數(shù)有關(guān)。R增加1倍，分析時間則是原來的4倍。實際工作中，即要能獲得有效的分離，又要在較短時間內(nèi)完成分析。例：兩物質(zhì)A和B在30cm長的色譜柱上的保留時間分別為16.4和17.63min，有一不與固定相作用的物質(zhì)，其在此柱上的保留時間為1.30min。物質(zhì)A和B的峰底寬分別為1.11和1.21min。試問：1）柱分辨率R；2）柱平均理論塔板數(shù)nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R達到1.5，則柱長至少應(yīng)為多少？5）使用上述較長的柱進行分析時，其分析時間為多長？6）不增加柱長，要求在原來的分析時間內(nèi)R達到1.5，該柱的塔板高度應(yīng)為多少？1）柱分辨率R；2）柱平均理論塔板數(shù)nav3）平均塔板高度Hav44）若要求R達到1.5，則柱長至少應(yīng)為多少？5）使用上述較長的柱進行分析時，其分析時間為多長？6）不增加柱長，要求在原來的分析時間內(nèi)R達到1.5，該柱的塔板高度應(yīng)為多少？第五節(jié)色譜方法選擇方法選擇根據(jù)試樣物理、化學性質(zhì)和分析要求來選擇色譜方法：各種氣體、沸點500℃以下具有揮發(fā)性的試樣，采用氣相色譜分析。非揮發(fā)性試樣，包括有機物、無機物、高分子化合物、可解離化合物采用高效液