第8章-PCR技術(shù)及其應(yīng)用-張靜2014

第八章PCR技術(shù)及其應(yīng)用前言PCR技術(shù)簡(jiǎn)史第一節(jié)PCR技術(shù)原理和工作方式第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆第三節(jié)PCR擴(kuò)增未知DNA片段第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR（自學(xué)）第五節(jié)PCR產(chǎn)生DNA指紋（自學(xué)）第六節(jié)實(shí)時(shí)定量PCR前言PCR技術(shù)簡(jiǎn)史鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：chainreaction核鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：指能自持進(jìn)行的原子核反應(yīng)。

DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1971年，Khorana(霍拉納)提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)設(shè)想ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis(穆利斯)等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E.coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，比喻1989年為PCR爆炸年，Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Taq

DNA聚合酶（Thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循環(huán)一、PCR的基本原理第一節(jié)PCR技術(shù)原理和工作方式TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon二、PCR反應(yīng)體系緩沖液脫氧三磷酸核苷(dNTPs)引物模板耐熱性的DNA聚合酶131

緩沖液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0，廠商提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，廠商提供，使用濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTPs、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs)

dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。dNTPs濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則1.引物長(zhǎng)度一般以18～30bp為宜。2.解鏈溫度(Tm值)直接決定了退火溫度(Ta值)的高低。兩條引物間的Tm值越接近越好。3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。3、引物

使用濃度為0.1-0.5mol/L。

濃度過(guò)低則產(chǎn)量低，過(guò)高則易導(dǎo)致錯(cuò)配，PCR特異性下降。4.要避免引物自身或引物間特別是3’末端堿基序列互補(bǔ)。5.G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布。6.引物3’末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3’末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高。7.引物5’末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。8.引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。4、模板單、雙鏈DNA均可。模板純度不高（混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類）往往是限制PCR擴(kuò)增的重要因素。一個(gè)PCR反應(yīng)中104至107個(gè)模板分子可獲得較理想的效果。不同屬性的模板所加的理想的量不同。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。5、耐熱性的DNA聚合酶均從耐熱性的細(xì)菌中分離出來(lái)，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性、耐熱性和附加功能上有差異。常用的有：1）TaqDNA聚合酶：最常用，95℃時(shí)的半衰期為40分鐘，75℃時(shí)活性最強(qiáng)，沒(méi)有校正功能。2）TthDNA聚合酶：95℃時(shí)的半衰期為20分鐘，74℃時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，在MnCl2催化下的高溫反轉(zhuǎn)錄功能。

3）VentDNA聚合酶：100℃時(shí)的半衰期為1.8小時(shí)，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。4）PwoDNA聚合酶：100℃時(shí)的半衰期大于2小時(shí)，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：具有極高的熱穩(wěn)定性，目前公認(rèn)是最保真的。

6）混合DNA聚合酶：將具有校正功能的酶與Taq酶按一定比例混合，具有類似Taq的強(qiáng)啟動(dòng)合成能力，同時(shí)又有一定的保真度，而且具有一定的擴(kuò)增長(zhǎng)片段的能力。Taq酶的延伸速度為1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min來(lái)預(yù)計(jì)。三、PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序：94℃左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘；

94℃左右變性5秒至1分鐘；50-65℃左右退火30秒至1分鐘；72℃左右延伸30秒至幾分鐘；72℃左右最后延伸和加尾3-10分鐘；4-25℃保持3分鐘或更長(zhǎng)。20-35個(gè)循環(huán)222、退火和延伸溫度：

退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5℃。當(dāng)退火溫度高到與延伸溫度接近時(shí)，可以將退火和延伸溫度合為一個(gè)，這時(shí)PCR就由三步法變成了兩步法。3、反應(yīng)時(shí)間：變性步驟一般為5秒至1分鐘。退火時(shí)間一般為30秒至1分鐘即可。延伸時(shí)間從半分鐘到10分鐘以上不等，由擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的延伸速度共同決定。Taq擴(kuò)增時(shí)按1kb/min計(jì)算，具校正活性的酶則按0.6-0.7kb/min計(jì)算。4、循環(huán)次數(shù)：多數(shù)為25-35，主要取決于模板屬性、模板豐度、引物退火效率、DNA聚合酶的擴(kuò)增能力。5、PCR反應(yīng)液的配制：加試劑順序：雙蒸水、緩沖液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。酶要用冰盒取放，禁止因手的接觸或暴露于空氣中而使酶升溫。第一次使用各試劑時(shí)要輕柔充分混勻。正確保存各種試劑，尤其是要避免核酸因反復(fù)凍融而降解，各試劑宜分裝成適量的小管。PCR儀1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR中其它注意的事項(xiàng)1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作2.設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板、無(wú)模板第二節(jié)PCR產(chǎn)物的克隆一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn)在PCR引物的5’加上根據(jù)需要而設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)（保護(hù)堿基），PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒(méi)有該切點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，直接用限制酶進(jìn)行切割，純化后與目標(biāo)載體連接重組。該法適用于直接將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體進(jìn)行功能研究，但構(gòu)建好的表達(dá)載體必須測(cè)序才能證明PCR產(chǎn)物的身份正確且沒(méi)有突變。二、A/T克隆這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，基本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進(jìn)行連接重組，測(cè)序證明正確無(wú)誤后，再?gòu)腡載體上亞克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行功能研究。Taq酶PCR產(chǎn)物的特點(diǎn)：該酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，通常在其產(chǎn)物DNA分子每條鏈的3’末端加上一個(gè)突出的A。T載體：通過(guò)特定制作技術(shù)制作的在多克隆位點(diǎn)中間已開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒載體，其每條鏈的3’末端具有一個(gè)突出的T。A/T克隆：將3’末端具一個(gè)突出的A的PCR產(chǎn)物與T載體連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組克隆子的多克隆位點(diǎn)區(qū)的插入片段進(jìn)行測(cè)序，然后再亞克隆到其它載體進(jìn)行功能研究等。PCR-TOPO技術(shù)：T載體上已經(jīng)偶連有拓?fù)洚悩?gòu)酶，因此PCR產(chǎn)物無(wú)需DNA連接酶而可直接與該T載體進(jìn)行快速連接重組。三、平末端DNA片段的克隆所有具有校正功能的DNA聚合酶擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路：一是在PCR完成后加入適量的Taq酶并在72℃保溫20-30分鐘，A/T克隆。二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端載體進(jìn)行連接克隆：1、pPCR-ScriptAmpSK(+)克隆載體：連接體系中除加有T4DNA連接酶外，還加有限制酶SrfⅠ，連接過(guò)程中載體自連的產(chǎn)物總是被SrfⅠ切開(kāi)，而重組載體確不能被切開(kāi)，轉(zhuǎn)化子中重組子的比例就較高。41422、pCR-Blunt克隆載體：載體的lacZ’基因下游融合了一個(gè)致死基因ccdB，載體自連轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能存活，重組載體的轉(zhuǎn)化子則能長(zhǎng)成菌落，因?yàn)橹滤阑蛞驯徊迦胧Щ睢Ｋ?、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增通常所用的PCR方法都在兩個(gè)方面有局限，即目標(biāo)產(chǎn)物精確程度和合成片段的大小。在常規(guī)的PCR反應(yīng)中，其產(chǎn)物一般在2kb以下。策略有：一是改進(jìn)PCR緩沖液體系、優(yōu)化PCR條件。二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴(kuò)增40kb左右的片段。一、反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆，擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。未知序列未知序列已知序列第三節(jié)PCR擴(kuò)增未知DNA片段已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶二、利用接頭的PCR/錨定PCR(anchoredPCR)

將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列已知的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與已知序列中的基因特異引物(gene-specificprimer,GSP)組合后，用于目標(biāo)基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增。錨定PCR技術(shù)進(jìn)行染色體步行的操作流程48三、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)

原理：利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprime,簡(jiǎn)稱sp1,sp2,sp3)，用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerateprime簡(jiǎn)稱AD)相組合，以基因組DNA作為模板，通過(guò)3輪具熱不對(duì)稱的溫度循環(huán)的分級(jí)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得已知序列旁的側(cè)翼序列。

49

第一輪產(chǎn)物第二輪產(chǎn)物第三輪產(chǎn)物第一輪模板為基因組DNA，引物SP1+AD第二輪將第一輪產(chǎn)物稀釋1-1000倍作為模板，SP2+AD第三輪將第二輪產(chǎn)物稀釋1-1000倍作為模板，SP3+AD已知序列(T-DNA)未知序列SP1SP2SP3AD

TAIL-PCR的操作流程：1.基因組DNA的獲取2.已知序列的驗(yàn)證3.引物的設(shè)計(jì)：3個(gè)嵌套的特異性引物長(zhǎng)度一般在20~30bp之間；Tm值一般設(shè)58~68℃；SP1、SP2和SP3之間最好相距100bp以上以便在電泳時(shí)更容易區(qū)分3輪PCR產(chǎn)物；隨機(jī)引物是按照物種普遍存在蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)的，長(zhǎng)度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之間。

4.三次TAILPCR反應(yīng)：第1次PCR反應(yīng)由5次高特異性反應(yīng)、1次低特異性反應(yīng)、10次較低特異性反應(yīng)和12次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)構(gòu)成。通過(guò)5次高特異性的反應(yīng)，使sp1與已知的序列退火并延伸；1次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；

接下來(lái)10次較低特異性的反應(yīng)使兩種引物均能與模板退火，從而使原來(lái)由高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)所產(chǎn)生的單鏈靶DNA復(fù)制成雙鏈DNA。最后是進(jìn)行12次熱不對(duì)稱的TAIL循環(huán)（超級(jí)循環(huán)即2次高特異性和1次低特異性循環(huán)交替），目的片段得以指數(shù)性地?cái)U(kuò)增。53

經(jīng)過(guò)第一輪的PCR反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物：類型1是特異引物和隨機(jī)引物之間擴(kuò)增的產(chǎn)物（即目標(biāo)產(chǎn)物；類型2是單獨(dú)由特異引物擴(kuò)增的產(chǎn)物；類型3是單獨(dú)由任意引物引發(fā)的產(chǎn)物。

增加目標(biāo)產(chǎn)物濃度

特異性增加目標(biāo)產(chǎn)物濃度

在第三階段結(jié)束后，基本上只有類型1產(chǎn)物，即目的產(chǎn)物。5.取第一，第二，第三輪PCR產(chǎn)物各3ul，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。6.切膠回收清晰的電泳條帶，以SP3為引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證?；騧RNA蛋白質(zhì)多肽鏈第四節(jié)與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增一、cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)用于克隆全長(zhǎng)cDNA的5’和3’末端序列。1、5’RACE原理示意圖2、3’RACE原理示意圖二、差異顯示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)檢測(cè)相似材料表達(dá)譜差異的經(jīng)典方法，此后已衍生出許多新方法。

DD-PCR是在AP-PCR(任意引物PCR)基礎(chǔ)上發(fā)明的一種RT-PCR方法，主要用于2種或多種類似生物個(gè)體在基因表達(dá)上的差異分析。基本原理：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同長(zhǎng)度的poly+(A)尾部序列，根據(jù)poly+(A)內(nèi)部的2個(gè)核苷酸排列的不同，可以將所有的mRNA分子分為12類。

根據(jù)這12種mRNA序列可合成12種相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物，即M’N’TTTTTTTT……，用其分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即可將所有mRNA分類合成12種cDNA（于12個(gè)試管內(nèi)），然后再用錨定引物和隨機(jī)引物，以這12種cDNA分別做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，那么與表型相關(guān)的mRNA就很容易被發(fā)現(xiàn)并克隆出來(lái)。真核生物12種mRNA的序列特點(diǎn)DD-PCR示意圖箭頭所示為特異擴(kuò)增產(chǎn)物一、多重PCR(multiplexPCR)：在一個(gè)反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。引物電泳第五節(jié)PCR產(chǎn)生的DNA指紋二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)：在高等真核生物龐大基因組背景下，引物長(zhǎng)度縮短到一定程度以后，單一引物就可以擴(kuò)增出多個(gè)PCR產(chǎn)物。RAPD引物一般為10-11nt。三、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplifiedfragmentpolymorphism,AFLP)：將高等真核生物基因組DNA酶切，連接接頭，然后進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增。PCR與模板定量：PCR最終產(chǎn)物是其模板一定程度的放大，因此PCR產(chǎn)物的量可以間接反映初始模板的量。但正因?yàn)镻CR是對(duì)初始模板的指數(shù)式擴(kuò)增，如果不同樣品之間在擴(kuò)增中偏離指數(shù)的程度稍有不同，用PCR產(chǎn)物來(lái)反映初始模板豐度就會(huì)有很大的誤差。通過(guò)特定設(shè)計(jì)的PCR儀器來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中每一輪產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好地推算初始模板豐度，這種工作方式叫做實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)。第六節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方式RT-qPCR儀同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)，監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)變化。閾值(threshold)：熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值。