實驗四肝臟DNA提取概論

實驗四肝臟DNA提取概論核酸是具有重要生物化學(xué)功能的生物大子，最初從細胞核分離出來，又具有酸性，故稱為核酸。

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)細胞核遺傳信息的攜帶者2021/4/272核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的生物合成，表達調(diào)控2021/4/273DNA的一般提取步驟：生物材料的選擇從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。對于低等生物。由于DNA分子量較小，提取時易保持其結(jié)構(gòu)完整性。細菌及高等動植物中，DNA分子量較大，易被機械張力剪斷。

2021/4/274細胞的破碎機械法物理法化學(xué)破碎方法酶學(xué)破碎方法2021/4/275細胞器的分離

在提取細胞線粒體和葉綠體DNA時，必須首先把線粒體和葉綠體與其它細胞器分離出來，一般采取在適當(dāng)介質(zhì)中的差速離心法分離。2021/4/276DNA的提取去除蛋白質(zhì)：酚、氯仿去除多糖、脂類：高鹽抑制DNase活性：去污劑，如SDS、CTABDNA的沉淀：乙醇或異丙醇2021/4/277DNA的純化有機溶劑抽提柱層析法梯度離心法酶溫和消化雜質(zhì)等2021/4/278DNA提取的幾種方法：濃鹽法

利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。陰離子去污劑法

由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵相結(jié)合，SDS或二甲苯酸鈉等陰離子去污劑能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性,從而破壞這種價鍵，因此可以采用陰離子去污劑提取DNA。此法可以直接從生物材料中提取DNA。

2021/4/279苯酚抽提法

苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。2021/4/2710實驗?zāi)康模赫莆諒膭游锝M織中提取、分離、純化DNA的基本原理及操作方法。學(xué)習(xí)DNA提取的一般知識；2021/4/2711實驗原理：在細胞核內(nèi)，核酸通常是與某些組織蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，即以脫氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。

2021/4/2712在提取時，通常采用0.14mol/L的鹽溶液來除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用濃鹽溶液來提取DNP。

在不同濃度的鹽溶液中，RNP與DNP的溶解度有很大的差別。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)2021/4/2713利用去污劑使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，而與DNA分離，本實驗使用的去污劑是SDS；利用蛋白質(zhì)不溶于氯仿-異丙醇，而DNA卻溶解于其中的性質(zhì)，將蛋白質(zhì)除去；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以進一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。2021/4/2714實驗材料、試劑與器材：實驗材料：新鮮豬肝試劑1）溶液A0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na2。2）溶液B0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L檸檬酸三鈉。3）溶液C1.5mol/LNaCl-0.15mol/L檸檬酸三鈉。4）溶液D3mol/L乙酸鈉-0.001mol/LEDTA-Na2。5）5mol/LNaCl。6）250g/LSDS。7）氯仿：異丙醇=24：1（V/V）。8）乙醇（70%、80%、95%、無水）。2021/4/27152.器材勻漿器或研缽研桿移液槍離心機天平恒溫水浴箱玻璃棒解剖剪及鑷子50ml離心管等2021/4/2716離心前請兩兩離心管配平，對稱放置。2021/4/2717⑴旋轉(zhuǎn)拇指按鈕設(shè)置吸取溶液的體積值，數(shù)字要完整地出現(xiàn)在顯示窗中；⑵套上槍頭，旋緊；⑶垂直持握可調(diào)式移液器用大拇指按至第一檔；⑷將槍頭插入溶液，徐徐松開大拇指，使其復(fù)原；⑸將可調(diào)式移液器移出液面，必要時可用紗布或濾紙拭去附于槍頭表面的液體(注意:不要接觸槍頭孔口)；⑹排放時，重新將大拇指按下，至第—檔后，繼續(xù)按至第二檔以排空液體。注意：移取另一樣品時，按卸尖按鈕棄掉吸頭并更換新吸頭。旋轉(zhuǎn)按鈕設(shè)置體積時，絕對不能超過每個移液器的最大值，扭過頭。2021/4/27181.將肝臟置于研缽中，搗碎，并加入5ml的溶液A。制成勻漿后，置于50ml離心管中，5000rpm離心8min。2.棄上清，加入溶液A4ml，然后滴加250g/LSDS溶液0.3ml，邊加邊用玻棒攪拌。3.加完后，置于60℃水浴保溫5min（不停攪拌），取出冷至室溫。4.加入5mol/LNaCl溶液1.0ml，攪拌5min，加入約一倍體積氯仿：異丙醇=24：1混合液，即5.3ml，振搖5min，離心8min（5000r/min）。小心吸取上清液至一干凈的50ml離心管中，記下體積，然后加入1.5倍體積95%乙醇，邊加邊用玻璃棒緩慢纏繞，DNA絲狀物即纏在玻璃棒上。操作步驟：2021/4/27195.將DNA粗制品置于溶液B2.7ml中，再加入溶液C0.3ml，攪勻，加入1倍體積氯仿：異丙醇=24：1混合液即3ml，振搖5min，離心8min（5000r/min），取上清，加入1.5倍體積95%乙醇，DNA即沉淀析出。離心8min（5000r/min），棄上清，沉淀為粗DNA。6.將上步所得沉淀物溶于溶液B中，加入溶液D0.3ml，攪勻。再加入氯仿：異丙醇=24：1混合液1.6ml，振搖，再加入1倍體積的95%乙醇，邊加邊攪，取出絲狀物DNA。2021/4/2720注意事項：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程；減