黃喉擬水龜腐皮病的確切病因探究,漁業(yè)論文

黃喉擬水龜腐皮病的確切病因探究,漁業(yè)論文黃喉擬水龜(Mauremysmutica)又稱石龜、石金錢龜、黃板龜、香龜?shù)?從屬于龜科(Emydidae)、擬水龜屬(Mauremys),具有較高食用、藥用及觀賞價值,已被列入(國家保衛(wèi)的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生野生動物名錄〕.近年來,黃喉擬水龜野生資源日趨減少,人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速,但水環(huán)境惡化及病害頻發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失.腐皮病是黃喉擬水龜養(yǎng)殖經(jīng)過中常見細菌性疾病之一[1-3],慢性感染導(dǎo)致黃喉擬水龜體表潰瘍、腐爛等[4].關(guān)于黃喉擬水龜腐皮病確實切病因至今不明,當(dāng)前尚未見文獻報道.2020年3月,江蘇省徐州市某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的黃喉擬水龜發(fā)生腐皮病慢性感染,病龜臨床異常感覺和狀態(tài)主要表現(xiàn)為,頭、頸、肢部皮膚潰爛,蛻皮、爪脫落,有腥臭味,嚴重感染導(dǎo)致死亡.本研究從黃喉擬水龜腐皮病灶進行細菌分離、生理生化試驗、16SrDNA序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,最終鑒定為類香味菌屬新種(Myroidessp.),對類香味菌的分離鑒定、動物感染和藥敏試驗等研究,以期為黃喉擬水龜腐皮病的診斷與防治提供參考.1材料與方式方法1.1材料1.1.1試驗用動物稚龜(平均體重8.0g,體長4.0cm)購自徐州市某花鳥市場,25℃飼養(yǎng)觀察1周,確認健康無病后用于試驗.1.1.2主要試劑LB培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管和藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品;PCR反響試劑2TaqPCRMasterMix,南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;細菌基因組DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;受體菌DH5由實驗室保存;1kbDNAladder(大小依次為:10000、8000、6000、5000、4000、3000、2500、2000、1500、1000、750、500、250bp)、pMD18-T克隆載體,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.細菌通用引物F27:AGTTT-GATCATGGCTCAG,R1492:GTTACCTTGT-TACGACTT,M13F:CAGGAAACAGCTAT-GACC,M13R:TGTAAAACGACGGCCAGT,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.1.2方式方法1.2.1病原菌分離純化無菌生理鹽水沖洗病龜體表病灶,無菌操作取病灶組織劃線接種于LB培養(yǎng)基,29℃恒溫培養(yǎng)24h.進一步挑取典型單菌落分離純化,獲得純種后進行革蘭染色鏡檢,并接種于試管斜面4℃保存?zhèn)溆?1.2.2菌株鑒定形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定無菌操作挑取適量分離菌接種于細菌生化鑒定管,29℃恒溫培養(yǎng)48h,觀察記錄結(jié)果.參照(伯杰氏細菌鑒定手冊〕,對分離菌進行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定.分子鑒定參照胡秀彩等[6]方式方法進行,采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌基因組總DNA,10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,置-20℃保存?zhèn)溆?以總DNA為模板,采用細菌通用引物進行16SrDNA基因PCR擴增,PCR體系為2TaqPCRMasterMix12.5L,上、下游引物各1L,DNA模板1L,ddH2O9.5L,PCR反響條件為:94℃4min;94℃40s,55℃40s,72℃1min,35個循環(huán);72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5,挑選陽性克隆,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.分離菌16SrDNA序列通過GenBank中的Blast進行類似序列檢索,ClustalX1.83軟件進行序列比對分析,采用MEGA4軟件鄰接法(Neighbor-joiningmethod)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并用Bootstrap對進化樹進行1000次可信度分析.1.2.3動物感染試驗分離菌接種于LB液體培養(yǎng)基29℃培養(yǎng)12h,取0.5mL菌液倍比稀釋,其余菌液于4℃保存,用傾注平板法測定菌液濃度,無菌生理鹽水稀釋至10^8CFU/mL.稚龜感染試驗采用腹腔注射法,每組6只稚龜,感染組每只稚龜注射0.1mL菌液,對照組注射等量無菌生理鹽水,連續(xù)觀察14d,記錄試驗結(jié)果.1.2.4藥物敏感試驗采用K-B法進行藥敏試驗,無菌操作將分離菌接種于LB平板,29℃培養(yǎng)24h,測量各藥敏紙片抑菌圈直徑,重復(fù)3次計算平均值.2結(jié)果2.1分離菌形態(tài)及培養(yǎng)特征從黃喉擬水龜腐皮病體表病灶處分離獲得1株細菌,編號為TSM13032;分離菌在LB培養(yǎng)基上生長良好,菌落呈淡黃色、半透明、外表光滑、濕潤、邊緣整潔;革蘭染色陰性,短桿菌,兩端鈍圓(圖1)2.2菌株鑒定2.2.1生理生化鑒定選用35項細菌生化編碼鑒定管對分離菌進行生化特性檢測,結(jié)果如表1所示,TSM13032菌株為氧化型,不能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,MR試驗、靛基質(zhì)、脲酶、鳥氨酸脫羧酶和DNA酶試驗均為陽性,硫化氫、V-P試驗、苯丙氨酸脫氨酶、明膠液化等試驗均為陰性.TSM13032菌株培養(yǎng)特性、生理生化特性,基本符合(伯杰氏細菌鑒定手冊〕類香味菌屬(Myroides)細菌特征.2.2.2分子鑒定以分離菌基因組DNA為模板,PCR方式方法擴增其16SrDNA序列,電泳檢測發(fā)現(xiàn)約在1500bp處有目的基因條帶,測序獲得TSM13032菌株16SrDNA片段大小為1482bp(圖2),序列遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為KF611897.將16SrDNA序列通過Blast軟件進行序列同源性檢索,TSM13032菌株16SrDNA序列與人源類香味菌屬新種(Myroidessp.)(登錄號:JX966100)基因序列同源性最高達99.92%,與類香味菌屬MyroidesodoratusATCC4651T(登錄號:M58777)、MyroidesphaeusMY15(登錄號:GU253339)、MyroidesodoratimimusCCUG39352T(登錄號:AJ854059)參考菌株基因序列同源性分別為93.84%、96.22%和95.87%.進一步選擇遺傳距離較近的13個參考菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)果顯示TSM13032菌株與類香味菌屬新種(Myroidessp.)(登錄號:JX966100)親緣關(guān)系近期,自然聚為一支(圖3),并且類香味菌屬(Myroides)菌株與黃桿菌屬(Flavobacterium)親緣關(guān)系較近;結(jié)合TSM13032菌株理化特征,最終鑒定為類香味菌屬新種(Myroidessp.).2.3動物感染試驗結(jié)果TSM13032菌株以10^8CFU/mL菌液腹腔注射稚龜,感染1d后出現(xiàn)精神委頓、行動延遲緩慢、食欲減退等異常感覺和狀態(tài),3d后眼分泌物增加、呈局部腐皮等異常感覺和狀態(tài),觀察14d后病龜無死亡現(xiàn)象,并且從體表病灶中重新分離獲得類香味菌;對照組稚龜正常.2.4藥物敏感性TSM13032菌株對24種抗生素進行藥敏試驗結(jié)果表示清楚(表2),TSM13032菌株對替考拉寧、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素、紅霉素、制霉菌素、四環(huán)素、利福平、克林霉素、呋喃妥因、復(fù)方新諾明,甲氧芐啶和潔霉素等14種抗生素耐藥;對諾氟沙星中度敏感;對氨芐西林、哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢噻吩、頭孢孟多、阿奇霉素、萘啶酸、氯霉素和磺胺異惡唑等9種抗菌藥物高度敏感.3討論類香味菌(Myroides)為腸桿菌科類香味菌屬細菌,廣泛分布于水、土壤及動物和人糞便中,是引起嚴重感染的條件致病菌之一,主要引起人尿路感染和術(shù)后傷口感染[7-8].關(guān)于類香味菌感染黃喉擬水龜腐皮病病原的分離鑒定,當(dāng)前尚未見文獻報道.類香味菌于1923年初次歸為黃桿菌屬(Flavobacte-ria),1996年將其重新歸為類香味菌屬(Myroides),包括氣味類香味菌(M.odoratus)和擬氣味類香味菌(M.odoratimimus)[9].最近幾年,相繼得到3個類香味菌新種:海洋類香味菌(M.pelagicus)、深海類香味菌(M.profundi)、馬里努斯類香味菌(M.ma-rinus)[10-12].本研究初次從黃喉擬水龜腐皮病體表中分離獲得類香味菌新種(Myroidessp.)TSM13032菌株,動物感染試驗證實,TSM13032菌株可引起稚龜感染發(fā)病,不能導(dǎo)致稚龜死亡,這可能與該菌為條件致病菌有關(guān).近期MarakiS等[7]初次報道動物咬傷引起類香味菌感染并導(dǎo)致嚴重發(fā)炎病例.KtariS等[8]從醫(yī)院尿路感染患者尿液中分離獲得擬氣味類香味菌(M.odoratimimus).杜迅等[13]從軟腐白菜根部土壤中分離病原菌,結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性確定為香味類香味菌.吳春篤等[14]為了解城市污水中病原菌污染狀況,通過構(gòu)建16SrDNA基因文庫發(fā)現(xiàn)污水中存在類香味菌,以為類香味菌可能通過污水傳播.國內(nèi)外關(guān)于水生類香味菌分離鑒定及其感染致病機制,當(dāng)前尚未見文獻報道.近年來,水產(chǎn)動物養(yǎng)殖經(jīng)過中抗生素廣泛使用導(dǎo)致細菌耐藥性不斷加強,增加了臨床治療難度.研究表示清楚,類香味菌產(chǎn)生染色體介導(dǎo)金屬酶,因此對絕大多數(shù)碳青霉烯類、氨基糖苷類等抗生素天然耐受[15-16].本研究對類香味菌進行藥物敏感試驗,結(jié)果顯示,1SM13032菌株對多種抗生素耐藥,對氨芐西林、哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢噻吩、頭孢孟多等-內(nèi)酰胺類藥物高度敏感.管福來等[16]從肺部感染病患痰液中分離獲得類香味菌對哌拉西林、氯霉素、紅霉素、磺胺異惡唑等藥物敏感.MarakiS等[7]研究表示清楚,引起臨床感染類香味菌對阿莫西林、氧氟沙星、氯霉素、磺胺異惡唑等高度敏感.KtariS等[8]對醫(yī)院感染類香味菌進行藥敏試驗顯示對多種抗生素耐藥,以為環(huán)丙沙星、利福平、磺胺異惡唑等是治療類香味菌感染有效藥物.本研究結(jié)果表示清楚,哌拉西林、磺胺異惡唑、氯霉素等為候選藥物,進而為類香味菌感染黃喉擬水龜腐皮病防治提供科學(xué)參考.以下為參考文獻:[1]黎小正,韋信賢,童桂香,等.黃喉擬水龜摩氏摩根菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報,2018,19(3):358-363.[2]黎小正,韋信賢,童桂香,等.黃喉擬水龜致病菌-松鼠葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2018,24(4):371-374.[3]譚愛萍,鄒為民,姜蘭,等.黃喉擬水龜體表潰瘍病原菌SG24的分類鑒定[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報,2007,27(3):64-68.[4]趙春光.龜鱉腐皮病的發(fā)生原因與有效預(yù)防[J].科學(xué)種養(yǎng),2018(4):47.[5]BrennerDJ,KriegNR,StaleyJT.Bergeysmanualofsys-tematicbacteriology(Secondedition,Vol.2)[M].NewYork:Springer,2004:105-245.[6]胡秀彩,邊延峰,趙臘梅,等.魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2020,34(12):232-235.[7]MarakiS,SarchianakiE,BarbagadakisS.Myroidesodoratimi-mussofttissueinfectioninanimmunocompetentchildfollowingapigbite:casereportandliteraturereview[J].TheBraziJIn-fectDis,2020,16(4):390-392.[8]KtariS,MnifB,KoubaaM,etal.NosocomialoutbreakofMy-roidesodoratimimusurinarytractinfectioninaTunisianhospi-tal[J].JHospitalInf