菌種選育、保藏與復(fù)壯2

五、原生質(zhì)體融合定義：

通過酶解作用將兩個親株的細(xì)胞壁去除，在高滲條件下釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體。然后將兩親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，加入融合促進(jìn)劑聚乙二醇、仙臺病毒或電融合等助融，使它們相互凝集。通過細(xì)胞質(zhì)融合，促使兩套基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在適宜條件下使細(xì)胞壁再生，在再生的細(xì)胞中獲得重組體。(1)(1)(2)(3)(4)原生質(zhì)體的融細(xì)胞雜交原生質(zhì)體融合回本章目錄（一）原生質(zhì)體融合技術(shù)的特點(diǎn)1、重組頻率較高2、受接合型或致育性的限制較小3、重組體種類較多4、遺傳物質(zhì)的傳遞更為完整5、采用溫度、藥物或紫外線照射等處理鈍化一方親株的原生質(zhì)體，然后再與另一親株的原生質(zhì)體融合，可去除一方親株，提高篩選效率6、與其他育種方法結(jié)合，提高篩選效率（二）原生質(zhì)體融合的主要驟標(biāo)記菌株的篩選原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體再生試驗(yàn)原生質(zhì)體的融合篩選穩(wěn)定的融合子優(yōu)良菌株的篩選

1、標(biāo)記菌株的篩選

選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補(bǔ)的兩個親株

為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性、菌落特征、細(xì)胞形態(tài)等.

抗青霉素，菌落小對青霉素敏感，菌落大抗青霉素菌落大

革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成溶菌酶微球菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌革蘭氏陰性菌不能直接溶壁，只有當(dāng)乙二胺四乙酸（EDTA）存在時，某些革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁才能夠被溶菌酶溶解。2、原生質(zhì)體制備

放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌也可采用溶菌酶真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)和葡聚糖等組成青霉菌多用纖維素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌細(xì)胞壁中的葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶菌體的前處理在菌體生理狀態(tài)酶的濃度菌齡：對數(shù)生長中期細(xì)胞的細(xì)胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。酶解溫度影響原生質(zhì)體制備的因素酶解時間滲透壓細(xì)菌中加入EDTA,甘氨酸、青霉素等，放線菌加入甘氨酸，可直接影響細(xì)胞壁正常合成以原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到最大的酶濃度為最適酶濃度。常用酶解范圍為20~40℃，具體情況具體分析通過實(shí)驗(yàn)選擇適宜酶解時間保持穩(wěn)定的等滲透壓至關(guān)重要，可采用滲透壓穩(wěn)定劑：細(xì)菌用蔗糖、氯化鈉；霉菌用氯化鉀、氯化鈉等。原生質(zhì)體形成率=破壁前菌數(shù)-低滲處理后剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)×100%3.原生質(zhì)體再生試驗(yàn)使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)酶解除去細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體應(yīng)具有再生能力，即能重新長成胞壁，恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)，并能正常生長繁殖，這是原生質(zhì)體融合的必要條件.原生質(zhì)體再生率=再生平板計(jì)數(shù)—低滲剩余菌數(shù)破壁前菌數(shù)—低滲剩余菌數(shù)×100%再生率

細(xì)菌為3-10%真菌在20-80%不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同，最重要的一個共同點(diǎn)是都需要高滲透壓4.原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-60%采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進(jìn)行融合影響原生質(zhì)體融合的因素有：促融劑的濃度、作用時間、陽離子濃度和pH等。當(dāng)然更重要的是親株本身特性的選擇，以及盡可能制備具有活力的原生質(zhì)體。

微生物原生質(zhì)體融合的一般原理和過程

原生質(zhì)體經(jīng)過融合得到的融合細(xì)胞出現(xiàn)兩種情況，一種是真正的融合，產(chǎn)生雜合二倍體(融合后的二倍體細(xì)胞分裂而不分離，分裂后的細(xì)胞仍保持二倍體狀態(tài))或單倍重組體；第二種情況是暫時的融合，形成異核體。5．融合子的選擇一融合子的遺傳分析

重組子的檢出方法有兩種：直接法將融合液涂布在補(bǔ)充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。6.優(yōu)良菌株的篩選

通過兩親株遺傳標(biāo)記的互補(bǔ)而得以識別兩親株的遺傳標(biāo)記分別為營養(yǎng)缺陷型A+B-和A-B+，融合重組子應(yīng)是A+B+或A-B-

。六、基因工程技術(shù)基因工程是現(xiàn)代生物工程技術(shù)的重要組成部分?；蚬こ逃址Q為遺傳工程、DNA重組技術(shù)、基因克隆?；蚬こ痰某霈F(xiàn)使遺傳學(xué)實(shí)現(xiàn)了一個巨大的飛躍，使遺傳學(xué)及育種研究可以按照人們的愿望有計(jì)劃地實(shí)施和控制。六、基因工程技術(shù)1、含目的基因DNA片斷的制備。2、選擇合適的載體。3、帶有目的基因的DNA片斷與載體連接。4、將重組的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，

在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。5、篩選和鑒定出帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。6、表達(dá)、鑒定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。

體外重組DNA技術(shù)基因重組轉(zhuǎn)化4.基因工程

回本章目錄（二）DNA重組的操作1、含目的基因DNA片斷的制備(1）限制性內(nèi)切酶(2)目的基因DNA片段的獲得

由兩個主要途徑獲得：一是從具有此基因片段的生物體染色體中分離二是根據(jù)已知的氨基酸順序或已有的互補(bǔ)RNA進(jìn)行合成。

2、基因工程常用的載體

載體是指在克隆其他DNA片斷時使用的運(yùn)載體，與外源DNA片段連接后也能在受體細(xì)胞中復(fù)制。(1)載體的種類：用于基因工程的載體有三類：質(zhì)粒載體；噬菌體載體；根據(jù)特殊要求構(gòu)建的載體

(2)質(zhì)粒的制備質(zhì)粒制備分三步進(jìn)行：細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增；細(xì)菌細(xì)胞收集和裂解；質(zhì)粒DNA提取。1）

質(zhì)粒（plasmid）

質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，在細(xì)菌中獨(dú)立于染色體之外而存在，存在普遍，幾乎所有細(xì)菌株系都含有質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒：質(zhì)粒在宿主中有10~100個拷貝低拷貝數(shù)質(zhì)粒:質(zhì)粒在宿主中只有1~4個拷貝

質(zhì)粒的特點(diǎn)1）

質(zhì)粒（plasmid）

質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)?；乇菊履夸浕蚬こ虒|(zhì)粒的要求構(gòu)建一種質(zhì)粒載體,對質(zhì)粒通常有以下幾個方面的要求:①質(zhì)粒載體的相對分子質(zhì)量應(yīng)盡可能小。實(shí)驗(yàn)證明，質(zhì)粒大于15kb時，其將外源DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌的幾率就會大大降低；②在宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制和穩(wěn)定地遺傳③應(yīng)該有用來克隆外源DNA的單一的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)④具有明顯的篩選標(biāo)記⑤能轉(zhuǎn)化比較廣的宿主細(xì)胞3．目的基因與載體的連接得到目的基因與載體后，把它們相互連接即進(jìn)行體外人工重組，其連接有4種方式。

(1)黏性末端連接(2)平頭連接(平齊末端連接)

(3)同聚末端連接——加接頭(4)人工接頭(人工黏性末端)4．重組DNA引入宿主細(xì)胞重組DNA只有進(jìn)入受體細(xì)胞才能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和表達(dá)。

5．重組體的篩選和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定(1)重組體的篩選(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定（三）微生物基因工程的應(yīng)用1、常規(guī)發(fā)酵工業(yè)

可通過基因工程獲得工程菌。2、提高菌種產(chǎn)量3、生產(chǎn)重要藥物中間體的工程菌4、基因工程藥物開發(fā)5、環(huán)保、生物固氮等。第二節(jié)菌種保藏與復(fù)壯菌種保藏：(1)目的：

①存活，不丟失，不污染②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

(2)原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動強(qiáng)度，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等）

二.菌種的復(fù)壯rejuvenation

狹義復(fù)壯

在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；廣義復(fù)壯

在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種，也稱生產(chǎn)育種。菌種的復(fù)壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。菌種的復(fù)壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。

②通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bt、白僵菌、多角體病毒等的復(fù)壯）；

③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。

④采用有效的菌種保藏方法。（1）劃線法：簡單、快捷。（2）稀釋法：菌落單一均勻。

純種分離方法一、固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌

步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻

步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。

步驟三更換一個新的無菌營養(yǎng)平板

步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。

步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九

在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器——震蕩機(jī)

吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液取含有9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時試管須做記號為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。

從最后稀釋菌液中吸取0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中

將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）

使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。

4.生產(chǎn)性能的測定

一般采用兩步法：

初篩：以量為主

復(fù)篩：以質(zhì)為主菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機(jī)構(gòu)：

中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典