微生物制片顯微觀察與檢測技術(shù)

微生物制片顯微觀察與檢測技術(shù)顯微操作顯微鏡是微生物檢驗(yàn)中最常用的精密光學(xué)儀器。顯微鏡的種類很多，在實(shí)驗(yàn)室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗(yàn)中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡。顯微鏡的使用方法

用光學(xué)顯微鏡觀察微生物形態(tài)時(shí)，一般遵循先低倍鏡觀察，后高倍鏡觀察，再油鏡觀察。

低倍鏡操作方法1.兩眼從側(cè)面注視低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，使用粗調(diào)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當(dāng)物鏡鏡頭與載物臺(tái)的玻片相距2～3mm時(shí)停止；2.左眼注視（注意右眼應(yīng)該同時(shí)睜著），并轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐上升，直到看清物象為止；3.再用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：粗調(diào)調(diào)焦螺旋只用于上調(diào)載物臺(tái)，如觀察顯微鏡時(shí)，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，有壓碎載玻片、損壞物鏡的危險(xiǎn)。因此，用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)視野使其更清晰高倍鏡操作方法1.將低倍鏡觀察到的目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將低倍鏡鏡頭轉(zhuǎn)換成高倍鏡鏡頭。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，因此一般選用較大的光圈并使用反光鏡的凹面；3.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。觀看的物體數(shù)目變少，但是體積變大。

注意：高倍鏡觀察時(shí)，光線需增強(qiáng)。油鏡操作方法1.將高倍鏡觀察到的目標(biāo)移動(dòng)至視野中央；2.將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油；3.將油鏡鏡頭移動(dòng)至視野，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴(kuò)大為止）；4.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：油鏡的操作需要較強(qiáng)的關(guān)線，故需將光線調(diào)至最強(qiáng)。用10倍和/或40倍物鏡為隨后的高倍油鏡（90倍或100倍）選擇合適的視野（油鏡鏡筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等標(biāo)志）油鏡用后的處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留的油跡；第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。普通顯微鏡的保養(yǎng)

(1)觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。(2)用過油鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。

(4)將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置，罩上防塵套。鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

染色方法(一)簡單染色法簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。(二)復(fù)染色法

用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G―表示細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。實(shí)驗(yàn)材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蠟筆等。2.草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液、石炭酸復(fù)紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌的簡單染色步驟涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

3．固定手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。

7．鏡檢(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20~30s，隨即水洗。5．用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上

步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

步驟4：風(fēng)干

步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘

步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

注意事項(xiàng)1．革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2．選用培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。微生物檢測技術(shù)介紹檢測技術(shù)的重要性革蘭氏染色鏡鑒按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定API試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn)

半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（ATBExpression）

全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（VITEK2）微生物鑒定MiniVIDAS篩選系統(tǒng)免疫凝集/免疫沉淀實(shí)驗(yàn)微生物檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)一、微生物檢驗(yàn)技術(shù)介紹傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)微生物的檢測技術(shù)c)酶聯(lián)免疫熒光技術(shù)d)實(shí)時(shí)熒光定量PCRe)免疫磁珠技術(shù)b)乳膠凝集反應(yīng)a)常規(guī)培養(yǎng)鑒定法—顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基檢測基本原理：利用不同種屬細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的酶的特異性，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特異性酶底物和抑制劑，當(dāng)具有某特異酶的細(xì)菌與酶底物作用時(shí)，使顯色基團(tuán)游離出來附著于菌落上，形成顏色獨(dú)特的菌落。根據(jù)菌落的顏色直接對(duì)菌屬（種）作出鑒定。

GB4789-2008、2010

中新技術(shù)的應(yīng)用-顯色培養(yǎng)基

沙門氏菌志賀菌副溶血性弧菌O157：H7大腸埃希菌單增李斯特菌阪崎腸桿菌大腸桿菌計(jì)數(shù)顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢快速、簡便、節(jié)省時(shí)間-大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)18~24h，即可根據(jù)菌落的顏色作出初步的鑒定。（陰性-棄去；陽性-進(jìn)一步鑒定）。結(jié)果直觀，一目了然（根據(jù)顏色判定結(jié)果）。靈敏度高、特異性強(qiáng)，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟（確證試驗(yàn)）。顯色培養(yǎng)的缺陷假陽性：97%的大腸埃希菌含有β-葡萄糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶。假陰性：O157：H7大腸埃希菌沒有β-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈陰性反應(yīng)。不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中呈陽性反應(yīng)。提示：這是任何選擇性培養(yǎng)基都無法避免的問題。與普通選擇性培養(yǎng)基比較，顯色培養(yǎng)基的假陽性、假陰性的機(jī)率相對(duì)要低得多。

乳膠凝集反應(yīng)

原理：乳膠凝劑試驗(yàn)是以乳膠微粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。用人工方法將抗體包被于與免疫無關(guān)的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳膠顆粒上。利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，當(dāng)敏感的乳膠顆粒與待檢細(xì)菌菌懸液混合后，迅速形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，用于篩選可疑菌。

常用Microgen乳膠凝集試驗(yàn)盒

李斯特菌（listeria）沙門氏菌（salmonella）彎曲桿菌（camylobacter）大腸桿菌O157（E.coliO157）軍團(tuán)菌（legionella）葡萄球菌（staph）

觀察凝集結(jié)果全自動(dòng)熒光免疫分析儀(VIDAS-mini或30)檢測項(xiàng)目：食品及環(huán)境中常見致病性細(xì)菌（李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸埃希菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測）的快速篩檢全自動(dòng)熒光免疫分析儀(VIDAS)原理：

以免疫技術(shù)捕獲目標(biāo)微生物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍(lán)色熒光（ELFA）。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標(biāo)本中抗原的含量成正比。特點(diǎn)：結(jié)果準(zhǔn)確：對(duì)每個(gè)標(biāo)本做兩次免疫反應(yīng)，保證結(jié)果的可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美國FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局等政府及權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可?？赏瑫r(shí)進(jìn)行12個(gè)相同或不同的測試。每天進(jìn)行約60—80項(xiàng)測試特異性強(qiáng)：標(biāo)本不需分離出目標(biāo)微生物即可上機(jī)檢測。避免交叉污染：沒有采樣針，避免標(biāo)本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標(biāo)本對(duì)環(huán)境的污染熒光定量PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)技術(shù)最具有代表性的技術(shù)。它是一種能在體外將微量生物DNA分子進(jìn)行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，通過熒光染料的結(jié)合，將檢測信號(hào)進(jìn)一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，擴(kuò)增和檢測過程由儀器自動(dòng)完成，檢測同量高，速度快除去樣品前增菌時(shí)間，2-4小時(shí)內(nèi)可得到檢測結(jié)果微生物檢測限可能達(dá)到1copy，抗雜菌干擾能力強(qiáng)

免疫磁珠技術(shù)由于受到抽樣數(shù)量、檢驗(yàn)方法和試驗(yàn)取樣量的限制，無法將全部樣品進(jìn)行檢查。磁珠分離技術(shù)，能簡單快速地捕捉特異的蛋白、遺傳物質(zhì)和其他生物分子。通過免疫磁珠富集手段，將微量的目標(biāo)物質(zhì)通過磁珠富集到可檢測的水平。這一技術(shù)不僅可應(yīng)用于致病微生物的檢測，還可用于食品中致敏原蛋白質(zhì)、核酸以及各類細(xì)菌毒素的富集，應(yīng)用范圍廣闊，適宜高通量、全自動(dòng)操作。Principle:ImmunomagneticMicroparticleSeparation/ConcentrationofBacterialCellsNBioLumixTM微生物實(shí)時(shí)快速檢測系統(tǒng)是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、飲料、化妝品、洗化產(chǎn)品和制藥等工業(yè)領(lǐng)域和監(jiān)管部門等使用的微生物快速檢測系統(tǒng)。可以快速確定樣本中細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群/大腸桿菌、致病菌、霉菌等的存在與數(shù)量。BioLumixTM實(shí)時(shí)快檢系統(tǒng)----簡便、快速并可降低微生物試驗(yàn)的操作成本。-裝有增菌培養(yǎng)基和指示劑的檢測管。-數(shù)小時(shí)內(nèi)得到檢測結(jié)果（而非數(shù)天）-結(jié)果易解釋并自動(dòng)傳輸?shù)叫枰焖侔l(fā)運(yùn)安全產(chǎn)品的地方。-非微生物專業(yè)技術(shù)人員也能夠操作?？蓹z測的項(xiàng)目:大腸菌群大腸桿菌腸桿菌科革蘭氏陰性菌乳酸菌酵母菌和霉菌假單胞菌蠟樣芽胞桿菌葡萄球菌沙門氏菌衛(wèi)生監(jiān)控保質(zhì)期預(yù)測腐敗菌檢測無菌檢驗(yàn)挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)微生物限定檢測嗜熱菌計(jì)數(shù)嗜冷菌計(jì)數(shù)抗生素殘留檢測生物體可以在BioLumix儀器中進(jìn)行孵育，孵育溫度可以在15