實驗三簡單染色法

實驗三簡單染色法第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日目的要求學習微生物涂片、染色的基本技術，掌握細菌的簡單染色法。初步認識細菌的形態(tài)特征。學習顯微鏡（油鏡）的使用方法，熟悉無菌操作技術。第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日簡單染色：利用單一染料對菌體進行染色。染料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團和助色基團的有機化合物。前者賦予染料顏色特征，后者使染料能形成鹽。常用的微生物細胞染料都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類：美藍（即亞甲藍）、結晶紫、堿性復紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料；酸性復紅、伊紅及剛果紅屬于酸性染料。第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷；堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，易與細胞結合使其著色。細胞處于酸性條件下（如細菌分解糖類產酸），所帶正電荷增加，可采用酸性染料染色。微生物染色原理第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日材料菌種金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌染色劑儀器或其他用具：顯微鏡酒精燈載玻片接種環(huán)香柏油二甲苯擦鏡紙生理鹽水等。第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日涂片干燥固定染色水洗鏡檢簡單染色方法干燥第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日作業(yè)實驗報告（結果部分：繪圖說明金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征，注明觀察時使用的物鏡及放大倍數）下一個實驗：革蘭氏染色法第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、涂片取一塊干凈的載玻片，平放，在載玻片中央滴一小滴生理鹽水；用接種環(huán)無菌操作從瓊脂斜面上挑取適量菌苔；將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、干燥將涂好菌膜的載玻片平放在室溫下自然干燥。也可用電吹風低溫吹干。第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日3、固定手持(木夾夾住)已干燥的涂有菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2~3次。原理：加熱使細菌細胞的蛋白質凝固，從而固定細菌細胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)。第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日4、染色將熱固定的細菌涂片平放于在載玻片架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。染色時間：呂氏堿性美藍染色1~2min；石炭酸復紅染色約1min草酸銨結晶紫染色約1min。第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日5、水洗將細菌涂片上染液倒入廢液缸中；手持細菌染色涂片，置于廢液缸上方，用洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無色為止。注意：水洗時，不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，過大，以免涂片薄膜脫落。第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日6、干燥自然干燥：平放于室溫，自然干燥；吹干：用電吹風冷風或低溫熱風吹干；吸干：平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細菌涂片兩面水分吸干。第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日7、鏡檢涂片干后鏡檢。防止水的折射，以便于觀察。第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日顯微鏡的基本結構（P41）1.物鏡轉換器2.物鏡3.標本夾4.載物臺5.聚光器6.彩虹光圈7.光源8.鏡座9.電源開關10.光源滑動變阻器11.粗調螺旋（粗調節(jié)器）12.微調螺旋（細調節(jié)器）13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.玻片夾推進器第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日顯微鏡使用操作步驟1、觀察前的準備2、顯微鏡觀察3、顯微鏡使用完畢后的處理第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、觀察前的準備仔細閱讀顯微鏡使用說明書取鏡（一手握鏡臂，一手托底座）顯微鏡的放置（平放，距邊緣約10cm）熟悉顯微鏡，檢查顯微鏡調節(jié)光源（光線均勻，亮度適宜）調節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡調節(jié)聚光器數值孔徑檢查顯微鏡物鏡、目鏡、聚光器第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、顯微觀察觀察程序如下：放置觀察標本低倍鏡觀察高倍鏡觀察油鏡觀察第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日將標本玻片置于載物臺上(注意標本朝上)，用標本夾夾住，移動推進器使觀察對象處于物鏡的正下方。放置觀察標本第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日下降低倍物鏡，從側面注視調節(jié)，使其接近標本。雙眼看目鏡，慢慢旋轉粗調節(jié)螺旋使鏡筒緩慢升起，至視野內出現物象后，改用細調節(jié)螺旋，上下微微轉動，直至視野內獲得清晰的物象。慢慢移動玻片夾推動器，尋找要觀察的部位，置于視野中心，觀察、記錄結果，并準備換高倍鏡觀察。低倍鏡觀察第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日將高倍物鏡轉至鏡筒下方(在轉換物鏡時，要從側面注視，以防低倍鏡未對好焦距而造成鏡頭與玻片相撞)。調節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細轉動微調螺旋，調節(jié)焦距，獲得清晰物象，移動推動器選擇最滿意的鏡檢部位，待油鏡觀察。

高倍鏡觀察物鏡的同焦現象（P44）第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日用粗調螺旋將鏡筒上升，轉動轉換器將油鏡轉至鏡筒正下方。在標本鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側面注視，慢慢轉動粗調螺旋，小心下降鏡筒，使油鏡浸入油中，并幾乎與標本接觸時為止(注意切勿壓到標本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭)。調節(jié)聚光器及照明后，眼看目鏡，微微轉動粗調螺旋將鏡筒上升，當視野中有模糊的標本物象時，改用細調螺旋，并移動標本直至標本物象清晰為止。油鏡觀察第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日油鏡的工作原理（P42）1、增加照明亮度2、增加顯微鏡的分辨率第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、增加照明亮度使用油鏡時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與接物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一層油質，稱為油浸系。如果玻片與物鏡之間的介質為空氣，則稱為干燥系。第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日一些物質的折射率：水1.33

玻璃1.52

空氣1.0

香柏油1.515第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、增加顯微鏡的分辨率分辨率（分辨力）是指顯微鏡能辨別物體兩點間最小距離的能力。式中=光波波長數值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度(稱鏡口角)的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質折射率所得的乘積，可用下列公式表示：其中第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日香柏油的折射率大于空氣和水，因此，它作介質時，數值孔徑值高于低倍鏡和高倍鏡。數值孔徑值越大，顯微鏡最小可分辨距離越小，即分辨率越高。

第二十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日觀察