實驗九微生物生理生化實驗

實驗九微生物生理生化實驗第一頁，共十九頁，2022年，8月28日一、實驗目的學習檢測微生物代謝特性的試驗方法掌握

淀粉水解試驗

糖發(fā)酵試驗

吲哚試驗VP試驗石蕊牛乳試驗的反應原理及操作第二頁，共十九頁，2022年，8月28日二、實驗原理

同種的細菌具有相同或相近的表型特征（形態(tài)、生理特征、代謝產(chǎn)物等），而細菌的生理特征，主要取決于酶的催化作用，但各種細菌具有不同的酶系統(tǒng)，從而導致代謝類型的多樣性。在所有生活細胞中存在的這些化學反應被稱為生理生化反應（酶促反應）。

人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生理生化反應作為重要的分類依據(jù)。第三頁，共十九頁，2022年，8月28日三、實驗材料1.實驗菌種：枯草桿菌（BS）、大腸桿菌（EC）2．培養(yǎng)基：（2人為一組）淀粉培養(yǎng)基（固體）：1皿/人糖發(fā)酵管(乳糖、葡萄糖、蔗糖各2只）：6支/組蛋白胨水培養(yǎng)基：4支/組葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：4支/組石蕊牛乳培養(yǎng)基：2支/組3．實驗開始前分別標記好每一組試管，一半為BS，一半為EC。第四頁，共十九頁，2022年，8月28日四、實驗內(nèi)容1.淀粉水解試驗（原理：淀粉遇碘變藍）細菌對大分子的淀粉不能直接利用，須靠產(chǎn)生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細菌吸收利用，細菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產(chǎn)生藍色。第五頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）倒平板，凝固后在培養(yǎng)皿底面兩側(cè)的中央位置分別標記BS或EC。（2）用接種環(huán)以點接的方式接上菌種。一邊接枯草桿菌BS，另一邊接大腸桿菌EC。（3）將接完種的平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7ｄ。（4）觀察結(jié)果時，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強弱，即產(chǎn)生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有無透明圈）具體操作：第六頁，共十九頁，2022年，8月28日2.糖類發(fā)酵試驗（含碳化合物的分解利用）原理及現(xiàn)象：不同糖類經(jīng)不同代謝途徑分解后可產(chǎn)生有機酸，氣體或二者都有，借助于溴甲酚紫顯色。第七頁，共十九頁，2022年，8月28日指示劑：溴甲酚紫（變色范圍pH5.2-6.8,pH<5.2黃色，pH>6.8紫色）pH<5.2,溶液由清亮紫色變?yōu)闇啙狳S色

乳酸、醋酸、丙酸葡萄糖/乳糖甲烷、氫、二氧化碳杜氏小管內(nèi)有氣泡，產(chǎn)氣漂浮第八頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌BS或大腸桿菌EC于葡萄糖、蔗糖、乳糖商品化發(fā)酵管中。以未接種的作為對照（全班1-2支試管即可）。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d。（3）觀察結(jié)果時，看各管顏色變化及小管頂部有無氣泡。產(chǎn)酸產(chǎn)氣用“⊕”表示；只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣用“+”表示；不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用“-”表示。具體操作：第九頁，共十九頁，2022年，8月28日色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚↑吲哚試劑

-+3.吲哚（indole）試驗：（含氮化合物的分解利用）第十頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于蛋白胨水培養(yǎng)基中。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d。以未接種的作為對照（全班1-2支試管即可）。（3）觀察結(jié)果時，在培養(yǎng)液中加入乙醚約1毫升（使呈明顯的乙醚層）。充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時，沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴。如吲哚存在，則乙醚層呈玫瑰紅色。（注意：加入吲哚試劑后，不可再搖動，否則紅色不明顯）。以“+”、“—”表示有無紅色的玫瑰吲哚。具體操作：第十一頁，共十九頁，2022年，8月28日4.VP實驗某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。第十二頁，共十九頁，2022年，8月28日2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸乙酰甲基甲醇CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3乙酰甲基甲醇NaOH丁二酮（二乙酰）第十三頁，共十九頁，2022年，8月28日取出塞子，

加10滴VP試劑，振蕩混合后，置沸水浴中保溫，5分鐘后觀察實驗結(jié)果。出現(xiàn)紅色這位VP試驗陽性。接種及培養(yǎng)方式如同吲哚實驗具體操作：第十四頁，共十九頁，2022年，8月28日5.石蕊牛乳試驗：（利用蛋白質(zhì)酪素的能力）牛乳的主要成分為乳糖，蔗糖，蛋白質(zhì)和酪素等成分。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原的指示劑（中性為黃色，酸性為紅色，堿性為藍色，石蕊被還原時，則部分或全部脫色）。由于各種細菌對牛乳的利用不同，引起培養(yǎng)基的變化也就不同，主要變化為：酸凝：主要從乳糖產(chǎn)生酸，指示劑變紅色。pH4.7以下時，有牛乳的凝固；如有氣體形成，則凝塊中有裂隙。凝乳酶凝固作用：很少或無酸產(chǎn)生，分泌凝乳酶使牛乳凝固。細菌產(chǎn)生蛋白酶可將干酪素分解產(chǎn)生胺或氨，使培養(yǎng)基的pH進一步升高，呈深藍紫色。胨化：酪蛋白被水解，部分或大部分牛奶變清亮?？稍谒嵝曰驂A性條件下進行，石蕊被還原脫色。第十五頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于石蕊牛乳培養(yǎng)基中。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7-14d。（3）觀察結(jié)果時，看各管顏色變化及牛乳胨化的現(xiàn)象。具體操作：第十六頁，共十九頁，2022年，8月28日五、實驗報告1．細菌對各種生理生化試驗反應的結(jié)果：淀粉水解試驗糖發(fā)酵試驗吲哚試驗VP試驗石蕊牛乳試驗乳糖葡萄糖蔗糖枯草桿菌大腸桿菌菌種名稱第十七頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）淀粉等生物大分子物質(zhì)能否不經(jīng)分解而直接被細菌吸收？