實(shí)驗(yàn)二PCR不跑電泳

實(shí)驗(yàn)二PCR不跑電泳第一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR的種類和PCR儀普通PCR梯度PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCRLongGeneABIBio-radEppendorf第二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日全觸摸屏PCR儀（Bio-Rad）第三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR）是模擬DNA的復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的方法，從而獲得大量的同一序列DNA。每經(jīng)過(guò)一輪擴(kuò)增，模板分子數(shù)增加一倍，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，模板分子數(shù)變?yōu)樵瓉?lái)的2n倍。第四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日Khorana(1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可合成tRNA基因?！?985年，KaryMullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開(kāi)車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片段；1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開(kāi)始學(xué)習(xí)PCR的方法。第五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日第六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日20212223N:MolecularnumberN0:Originalnumbern:CyclesE:efficiencyN=N0X2nPCR的指數(shù)擴(kuò)增N=N0X（1+e)n第七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR擴(kuò)增過(guò)程DNA模板變性退火:引物+模板新鏈延伸50~60℃72℃30-40次循環(huán)引物耐熱的DNA聚合酶退火溫度：45-60℃延伸時(shí)間：1-2kb/min循環(huán)數(shù)：30-40第九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR試劑的作用及使用濃度范圍1、DNA模板(template)：λ

噬菌體的質(zhì)粒DNA(幾納克~幾微克)2、dNTP:4種dNTP混和物。20-200umolL。大于50mmol/L可抑制Taq酶的活性。3、10×PCR緩沖液(buffer):組分如下:

15mmol/LMgCl2（影響引物退火和解鏈的溫度，影響產(chǎn)物的特異性，影響引物二聚體的形成。濃度范圍：。濃度太低無(wú)PCR擴(kuò)增，太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增）

500mmol/LKCl(有利于引物與模板退火，濃度太高則抑制酶活性)、

100mmol/LTris.HCl(pH8.3)（緩沖PH）

0.1%明膠（穩(wěn)定酶的活性）4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）（引物終濃度：）6、TaqDNA聚合酶第十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日《分子克隆3》提供的PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件：模板1pg-1μg引物1μmol/LDNA聚合酶1－5單位Mg2＋1.5mmol/LdNTPs200μmol/LKCl50mmol/L第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素1.引物的質(zhì)量與特異性；2.

PCR循環(huán)條件（退火溫度）；3.Mg2+濃度；4.模板DNA的質(zhì)量；5.酶的質(zhì)量。第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日DNA模板模板濃度：0.01-1ng（plasmid,phage）；0.1-1ug（genomicDNA）；10倍稀釋（cDNA）;模板中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)模板中是否含有Taq酶抑制劑（苯酚）第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日Enzymeconcentration

TaqDNApolymeraseisbetween1and2.5units.

催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少dNTP

Aworkingstockcontaining1mMeachdNTPisrecommendeddNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，多次凍融會(huì)使dNTP降解。第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日Mg2+濃度：

0.5-2.5mM較合適。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。引物濃度：引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。第十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日變性溫度和時(shí)間

：94-95Cfor30seconds。

變性不完全,往往使PCR失敗，但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。退火溫度：

通常PCR的退火溫度選擇為T(mén)m-5oC;

退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán),既省時(shí)間又提高了特異性。

引物為20mer以下時(shí)：Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)

引物為20mer以上時(shí)：Tm=81.5十0.41×(GC％)-600/L其中L為引物的長(zhǎng)度。第十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日

延伸時(shí)間：1-2kb/min.

延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)很低濃度的目的序列,則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物。

循環(huán)數(shù)：

35cycles

循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。第十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日退火溫度對(duì)PCR產(chǎn)物量和特異性的影響第十八頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR常見(jiàn)問(wèn)題假陰性：

無(wú)擴(kuò)增條帶（漏加模板、引物或酶；酶失效等；引物不合適）假陽(yáng)性：非特異性擴(kuò)增帶（退火溫度偏低；引物不合適；Mg2+濃度不合適）；

第十九頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日為什么可以通過(guò)PCR擴(kuò)增得到特異片段模板DNA1st2nd3rd特異性擴(kuò)展片段%=0%特異性擴(kuò)展片段%=25%特異性擴(kuò)展片段%=50%4th特異性擴(kuò)展片段%=68.75%.....第二十頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR的特點(diǎn)簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～3小時(shí)完成擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳方法即可檢測(cè)分析對(duì)標(biāo)本的要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等的粗提DNA靈敏度高理論上1～3個(gè)DNA分子經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得百萬(wàn)以上個(gè)相同的DNA分子特異性強(qiáng)擴(kuò)增的產(chǎn)物與模板分子特異區(qū)域完全相同第二十一頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR的應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)，腫瘤檢測(cè)和診斷，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，動(dòng)植物檢疫法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析其他……第二十二頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、DNA模板(template)：λ

噬菌體的質(zhì)粒DNA2、dNTP:4種dNTP混和物3、10×PCR緩沖液(buffer):組分如下:

15mmol/LMgCl2

500mmol/LKCl100mmol/LTris.HCl(pH8.3)

0.1%明膠4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）（見(jiàn)“實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)”）6、TaqDNA聚合酶(Taqpolymerase)

第二十三頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR的基本步驟1、PCR反應(yīng)體系的建立取0.2ml的薄壁離心管，按表1順序加入試劑→稍混勻，短暫離心把溶液甩至管底。2、PCR的變溫程序（熱循環(huán)反應(yīng)）按表2設(shè)置PCR反應(yīng)的變溫程序→把離心管放進(jìn)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增→反應(yīng)結(jié)束后低溫保存或檢測(cè)3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)(下次實(shí)驗(yàn))第二十四頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR的基本步驟1、PCR反應(yīng)體系的建立（2人一組）取0.2ml的薄壁離心管，按表1順序加入試劑→稍混勻，短暫離心把溶液甩至管底。試劑標(biāo)記成份1份體積(μl)H2OddH2O17.3Buffer10×反應(yīng)緩沖液2.5dNTPdNTPs(2.5mMeach)2P1引物1（10uM）1P2引物2（10uM）1DNAλDNA1rTaqrTaq酶0.2總體積25表1PCR反應(yīng)體系第二十五頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日2、PCR的變溫程序（熱循環(huán)反應(yīng)）

按表2設(shè)置PCR反應(yīng)的變溫程序→把離心管放進(jìn)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增→反應(yīng)結(jié)束后低溫保存或檢測(cè)反應(yīng)階段循環(huán)數(shù)

溫度持續(xù)時(shí)間1194℃（預(yù)變性）3min23594℃（變性）30s52℃（退火）30s72℃（延伸）30s3172℃（補(bǔ)充延伸）10min4112℃置于12℃可短時(shí)間保存PCR產(chǎn)物；若需長(zhǎng)時(shí)間保存取出后置-20℃保存表2PCR反應(yīng)的變溫程序第二十六頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日引物設(shè)計(jì)第二十七頁(yè)，共三十一頁(yè)，2022年，8月28日PCR引物設(shè)計(jì)的原則引物長(zhǎng)度：16-30nt(20±2nt)G+C%：40-60%四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3’末端不存在連續(xù)3個(gè)G或C在引物內(nèi)，尤其是在3’端不應(yīng)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)（引物內(nèi)互補(bǔ)配對(duì)）兩個(gè)引物之間，尤其是3’端不能互補(bǔ)。兩引物間最好不存在4個(gè)連