實(shí)驗(yàn)六高效液相色譜法

實(shí)驗(yàn)六高效液相色譜法第一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日20.1.1高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)的產(chǎn)生。

薄殼型填料，柱效僅每米1000~3000塔板數(shù)5~10μm球型和無(wú)定型微粒硅膠，每米5~6萬(wàn)理論塔板數(shù)高度均勻甚至單分散1~3μm硅膠基質(zhì)球形填料，達(dá)15~30萬(wàn)理論塔板/m。新型分離模式和方法不斷增加第二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日基本特點(diǎn)

1.高效、高速、高靈敏度、高選擇性

2.填料粒徑和流動(dòng)相性質(zhì)影響色譜柱效

3．局限性操作條件

1.流動(dòng)相對(duì)分離選擇性的影響

2.柱外效應(yīng)

3.操作壓力

適用范圍廣20.1.2.高效液相色譜法的特點(diǎn)及與其他色譜法比較第三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日1.吸附色譜(adsorptionChromatography)2.分配色譜(partitionChromatography)3.離子交換色譜(ion-ExchangeChromatography)4.體積排阻色譜(sizeExclusionChromatography)

需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機(jī)理，但可能還存在次要的其他機(jī)理。

20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系

根據(jù)固定相和液體流動(dòng)相相對(duì)極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動(dòng)相和固定相的相對(duì)極性，最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于其他各種色譜方法。第四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

上述每種色譜類型均可進(jìn)一步分為多個(gè)不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用互相補(bǔ)充。

20.1.3.高效液相色譜法分類和正反相色譜體系第五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

現(xiàn)代高效液相色譜使用3~10μm柱填料，為達(dá)到適用的流動(dòng)相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復(fù)雜和昂貴。20.2.高效液相色譜儀HPLC示意圖第六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日20.2.高效液相色譜儀第七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個(gè)流動(dòng)相儲(chǔ)液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個(gè)儲(chǔ)瓶容積500~2000mL。儲(chǔ)液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動(dòng)時(shí)易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過(guò)放空閥排出。儲(chǔ)器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測(cè)器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲(chǔ)液器的溶劑導(dǎo)管入口處裝有過(guò)濾器，以進(jìn)一步除去溶劑中灰塵或微粒殘?jiān)乐箵p壞泵、進(jìn)樣閥或堵塞色譜柱。20.2.1.流動(dòng)相貯器和溶劑處理系統(tǒng)第八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液壓；輸出無(wú)脈動(dòng)恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒(méi)有爆炸危險(xiǎn)，因?yàn)橐后w的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復(fù)柱塞泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點(diǎn)。往復(fù)柱塞泵20.2.2.高壓泵系統(tǒng)1.電機(jī)，2.往復(fù)凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液?jiǎn)蜗蜷y，5.溶劑入口，6.脈動(dòng)阻尼器,7.接色譜柱。第九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

進(jìn)樣閥20.2.3.進(jìn)樣系統(tǒng)六口旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥示意圖第十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離的性能不受影響。20.2.4.高效液相色譜柱第十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日1.色譜柱類型

按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類型。20.2.4.高效液相色譜柱2.保護(hù)柱

一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長(zhǎng)使用壽命。3.柱恒溫器

對(duì)色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。第十二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。20.2.5.液相色譜檢測(cè)器第十三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

l.光吸收檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器，光二極管陣列檢測(cè)器，紅外吸收檢測(cè)器2.熒光檢測(cè)器

3.示差折光率檢測(cè)器4.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器5.電化學(xué)檢測(cè)器

20.2.5.液相色譜檢測(cè)器第十四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日20.3.1.高效液相色譜固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

20.3.高效液相色譜固定相和流動(dòng)相第十五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：1.化學(xué)惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。2.適用的物理性質(zhì)，包括沸點(diǎn)較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無(wú)紫外吸收等，以降低UV檢測(cè)器本低響應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度;對(duì)樣品具有適當(dāng)溶解能力等。3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)廉等，便于操作和安全。20.3.2.液相色譜流動(dòng)相第十六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日20.3.2.液相色譜流動(dòng)相第十七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類型?？煞譃橐?液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面?；瘜W(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的分配色譜類型。20.5.分配色譜(PartitionChromatography)第十八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日液一液分配色譜法（LLPC）在液-液色譜中，流動(dòng)相和固定相都是液體，能適用于各種樣品類型的分離和分析（極性的和非極性的、水溶性和油溶性的、離子型的和非離子型的化合物）。（1）分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。第十九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）固定相由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β,β一氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。代替了固定液的機(jī)械涂漬，它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。約有3/4以上的分離分析是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。第二十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）流動(dòng)相在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相與固定相盡可能不互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。第二十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

體積排阻或排除色譜(Size-ExclusionChromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過(guò)濾色譜,是分析高分子化合物的色譜技術(shù)。SEC