臨床免疫學(xué)和免疫檢驗第六章 沉淀反應(yīng)講義

第六章沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象第一節(jié)沉淀反應(yīng)的特點沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。沉淀反應(yīng)分兩個階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，幾秒到幾十秒即可完成，出現(xiàn)可溶性小的復(fù)合物，肉眼不可見;第二階段為形成可見的免疫復(fù)合物，約需幾十分鐘到數(shù)小時才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗_、絮狀沉淀試驗抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原和抗體比例的直接影響因此常用來作為測定抗原抗體反應(yīng)最適比例的方法，常見類型有：一）抗原稀釋法抗原進(jìn)行一系列稀釋與恒定濃度抗血清反應(yīng)。二）抗體稀釋法抗體進(jìn)行一系列稀釋與恒定濃度抗原反應(yīng)。三）方陣滴定法方陣滴定法即棋盤滴定法。二、免疫濁度測定屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，其特點是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可進(jìn)行液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測。（一）免疫比濁測定的影響因素1?抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素。當(dāng)抗原過量時，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射亦減少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)。當(dāng)抗體過量時,IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達(dá)最高峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。在反應(yīng)體系中保持抗體適當(dāng)過量，如形成抗原過量則造成測定的準(zhǔn)確性降低。2?抗體的質(zhì)量對免疫比濁測定法的抗體要求（1） 特異性強（2） 效價高（3） 親和力強:則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)的速度，而且形成的IC較牢固，不易發(fā)生解離。在速率比濁法中尤為重要。（4） R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來源的動物種類不同，分為R型抗體和H型抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動物被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類抗血清的特點是親和力較強，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離。H型抗體是指以馬為代表的大型動物注射抗原后制備的抗血清,這類抗血清的親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易解離抗原抗體反應(yīng)的溶液反應(yīng)液最適pH為6.5?8.5,否則不易形成IC，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi)，離子強度大，IC形成越快：離子的種類也可影響IC的形成。一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應(yīng)液。增濁劑某些非離子型親水劑對促進(jìn)IC的形成有顯著的增強作用，如聚乙二醇（PEG）、吐溫-20,其作用是消除蛋白質(zhì)（抗原或抗體）分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。（二） 免疫比濁法方法分類1?透射免疫比濁法通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復(fù)合物。2?免疫膠乳比濁法是以膠乳作為載體對小分子免疫復(fù)合物進(jìn)行微量測定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測定的靈敏度。散射免疫比濁法通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強度來定量抗原抗體的復(fù)合物。該法根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時間和反應(yīng)結(jié)合的動力學(xué)，又可分為終點散射比濁法、固定時間散射比濁法和速率散射比濁法。（三） 免疫比濁法應(yīng)用血液、體液中蛋白質(zhì)的測定如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、補體C3、補體C4、血漿蛋白（前白蛋白、a-抗胰蛋白酶、a-酸性糖蛋白、a2-巨球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、結(jié)合球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白）。尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒物和各種治療性藥物）。（四） 免疫比濁法優(yōu)點穩(wěn)定性好敏感度高（達(dá)ng/L）3?精確度高（CVV5%）簡便快速，易于自動化無放射性核素污染，適合于大批量標(biāo)本的檢測第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。凝膠支持物的種類有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠等。不同分子量的物質(zhì)在凝膠中擴(kuò)散速度不同，借此可用以識別不同待測物分子量的差別。一、單向擴(kuò)散試驗在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。（一） 試管法將一定量的抗體混入0.7%瓊脂糖溶液中，注入小試管內(nèi)，上層加抗原溶液使待測抗原在凝膠中自由擴(kuò)散，在抗原抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。較少采用。（二） 平板法是將抗體或抗血清混入0.9%瓊脂糖凝膠內(nèi)，未凝固前傾注成平板，然后在上打孔，將抗原加入孔中，放37衛(wèi)讓其自由擴(kuò)散，24?48小時后可見孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)，測定環(huán)的直徑或面積計算標(biāo)本中待測抗原的濃度。有兩種計算方法：Mancini曲線適用大分子抗原和長時間擴(kuò)散（＞48小時）的結(jié)果，沉淀環(huán)直徑的平方?）與抗原濃度（c）呈線性關(guān)系：c/d2=k。Fahey曲線適用于小分子抗原和較短時間擴(kuò)散的結(jié)果處理,用半對數(shù)紙畫線，濃度對數(shù)logc與擴(kuò)散環(huán)直徑（d）呈線性關(guān)系：logc/d=k（其中c為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑，k為常數(shù)）。（三） 影響因素抗血清必須特異性強、效價高、親和力強，在良好條件下保存。每次測定都必須作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次測定時必須用質(zhì)控血清作質(zhì)控。注意雙環(huán)現(xiàn)象（出現(xiàn)了兩種抗原性相同成分）。二、雙向擴(kuò)散試驗雙向擴(kuò)散試驗是讓抗原和抗體在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在比例恰當(dāng)之處形成沉淀線，沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可對抗原或抗體進(jìn)行定性分析。雙向擴(kuò)散試驗簡單易行，用途廣泛，但該技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量，這些弱點在相當(dāng)程度上限制了它的應(yīng)用。根據(jù)試驗形式可分為試管法和平板法兩種。（一） 試管法（二） 平板法是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據(jù)沉淀線的有無、形態(tài)和位置可作如下分析：抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計（1） 沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大（2） 沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大（3） 不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應(yīng)的抗體（抗原）或者抗原過量抗原或抗體相對分子量的分析（1） 抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴(kuò)散快，反之則較風(fēng)（2） 由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方；如果兩者分子量大致相等，則形成直線?？乖再|(zhì)的分析（1） 兩條沉淀線互相吻合相連，表明抗體與兩個抗原中的相同表位結(jié)合而沉淀,兩個抗原相同（2） 沉淀線呈部分相切，說明兩個抗原之間有部分相同（3）兩條沉淀線交叉而過，說明兩個抗原完全不同抗體效價的滴定雙向擴(kuò)散試驗是抗血清抗體效價滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原和抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴(kuò)散，形成沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體的效價?？乖蚩贵w純度鑒定用混合抗原或抗體鑒定抗體或抗原，出現(xiàn)一條沉淀線說明待測抗原或抗體純，出現(xiàn)多條沉淀線說明不純。雙向擴(kuò)散試驗簡單易行，用途廣泛，但該技術(shù)靈敏度低，出現(xiàn)結(jié)果慢，不能精確定量，這些弱點在相當(dāng)程度上限制了它的應(yīng)用。第四節(jié)免疫電泳技術(shù)電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。一、優(yōu)點（一）加快了沉淀反應(yīng)的速度；（二）電場規(guī)定了抗原抗體的擴(kuò)散方向，使其集中，提高了靈敏度；（三）可將某些蛋白組分根據(jù)其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)。本法既具有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又具有電泳技術(shù)的高分辨率和快速、微量等特性，因此其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。隨著實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫電泳技術(shù)逐步發(fā)展為對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳等多項實驗技術(shù)，廣泛用于科學(xué)研究和臨床實驗診斷分析。二、對流免疫電泳雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。在pH8.6緩沖液中，大多蛋白質(zhì)帶強負(fù)電荷，在電場中向正極移動；而IgG等電點偏高（pH6?7）,在辿時帶負(fù)電荷較少，且分子量較大，移動速度慢，故向正極移動緩慢甚至不移動。在凝膠的電滲作用下，隨水流向負(fù)極，電滲引向負(fù)極移動的液流速度超過了IgG向正極的移動速度，因此抗體移向負(fù)極，在抗原抗體最適比處形成沉淀線。IgG作為蛋白質(zhì)在電泳中比較特殊，4個亞型有不同的表現(xiàn)，IgG3和IgG4與一般蛋白質(zhì)無異，泳向正極，而IgGl和IgG2則因其帶電荷少，受電滲的作用力大于電泳，所以被水分子挾裹向負(fù)極移動。這就形成了IgG的特殊電泳形式：一部分泳向正極，另一部分泳向負(fù)極，在抗體孔兩側(cè)都有抗體存在，因此所謂對流只是部分IgG的電滲作用所致三、火箭免疫電泳單向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一項定量檢測技術(shù)，實質(zhì)上是加速的單向擴(kuò)散試驗。實驗時，將抗體混合于瓊脂中，樣品孔中的抗原置于負(fù)極端，電泳時抗體不移動，抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少,抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰。當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)，因此用已知標(biāo)準(zhǔn)抗原作對照，抗原濃度為橫坐標(biāo)，峰的高度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品濃度就可根據(jù)沉淀峰的高度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算獲得。火箭電泳作為抗原定量只能測定Pg/ml以上的含量，如低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。加入少量125標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用X線膠片顯影，可出現(xiàn)放射顯影，這就是目前采用的免疫自顯影技術(shù)，根據(jù)自顯影火箭峰降低的程度（競爭法）可計算出抗原的濃度。免疫自顯影技術(shù)可測出ng/ml的抗原濃度。四、 免疫電泳區(qū)帶電泳與免疫雙擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫分析技術(shù)，為定性試驗。先用區(qū)帶電泳技術(shù)將抗原在凝膠中電泳，分成肉眼不可見的若干區(qū)帶，電泳停止后，沿電泳方向挖一與之乎行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，置室溫37°C作雙向擴(kuò)散，經(jīng)18?24小時后，已分離成區(qū)帶的各種抗原成分與抗體槽中相應(yīng)抗體在兩者比例適合處形成弧形沉淀線。免疫電泳所需擴(kuò)散時間長，沉淀線的數(shù)目和分辨率又受許多因素影響，且結(jié)果較難分析，必須積累經(jīng)驗，才能作出恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。免疫電泳為定性試驗，目前主要應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別與鑒定方面，例如多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧。五、 免疫固定電泳可用于各種蛋白質(zhì)的鑒定。該方法原理是先將待檢樣品在凝膠板上作區(qū)帶電泳，將蛋白質(zhì)分離成不同區(qū)帶，然后在其上覆蓋抗血清，當(dāng)抗血清與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合，便形成抗原抗體復(fù)合物而沉淀。最后通過漂洗和染色，并與蛋白質(zhì)參考泳道對照分析，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。本法可用于遷移率近似的蛋白和M蛋白的鑒定與分型，免疫球蛋白輕鏈，尿液中的本-周蛋白檢測及k、入分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測及分型，鑒定游離輕鏈，補體裂解產(chǎn)物等。免疫固定電泳最大的優(yōu)勢是分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，結(jié)果易于分析。六、 交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合的免疫電泳分析技術(shù)。是一種有效的抗原蛋白定量技術(shù)，可一次同時對多種抗原定量。分辨率較高，有利于各種蛋白組分的比較，對于蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性、微小異質(zhì)性、蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物和不正常片段等進(jìn)行定性分析。（1?4題共用答案）帶現(xiàn)象前帶后帶等價帶拖尾現(xiàn)象沉淀反應(yīng)中抗原過量的現(xiàn)象稱為『正確答案』C『答案解析』沉淀反應(yīng)中抗原過量的現(xiàn)象稱為后帶。沉淀反應(yīng)中抗體過量的現(xiàn)象稱為『正確答案』B『答案解析』沉淀反應(yīng)中抗體過量的現(xiàn)象稱為前帶。沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為『正確答案』D『答案解析』沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為等價帶。沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為『正確答案』A『答案解析』沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原可溶性抗原半抗原超抗原致敏抗原『正確答案』B『答案解析』沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。關(guān)于免疫濁度法測定錯誤的是反應(yīng)液中抗體過量反應(yīng)液中抗原過量反應(yīng)液中抗原、抗體比例合適常用聚乙二醇等增濁劑通常用磷酸鹽反應(yīng)液『正確答案』B『答案解析』當(dāng)抗原過量時，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少,這就是高劑量鉤狀效應(yīng)。下列有關(guān)沉淀反應(yīng)第一階段的說法，錯誤的是抗原抗體的特異性結(jié)合幾秒鐘至幾分鐘內(nèi)即完成可用散射比濁測定反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)肉眼見不到免疫復(fù)合物『正確答案』D『答案解析』沉淀反應(yīng)分兩個階段，第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，幾秒到幾十秒即可完成，出現(xiàn)可溶性小的復(fù)合物，肉眼不可見；第二階段為形成可見的免疫復(fù)合物，約需幾十分鐘到數(shù)小時才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。免疫沉淀反應(yīng)常用于顆粒性抗原檢測抗原抗體的結(jié)合瞬間肉眼可見用于可溶性抗原的檢測不能用于定量檢測可不考慮抗原抗體的比例『正確答案』C『答案解析』免疫沉淀反應(yīng)用于可溶性抗原的檢測。關(guān)于單向擴(kuò)散實驗錯誤的是需先將抗原混入瓊脂內(nèi)有試管法和平板法需先將抗體混入瓊脂內(nèi)可用于定量檢測抗原抗體的比例合適處形成沉淀環(huán)『正確答案』A『答案解析』單向擴(kuò)散試驗是在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。有試管法和平板法。通過觀察雙向瓊脂擴(kuò)散試驗的結(jié)果，不能解決的問題是是否存在相應(yīng)的抗原或抗體抗原和抗體相對含量的估計抗原和抗體相對分子量的分析判斷兩種抗原的性質(zhì)是否相同抗體濃度的確定『正確答案』E『答案解析』雙向擴(kuò)散試驗是讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在比例恰當(dāng)之處形成抗原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可對抗原或抗體進(jìn)行定性分析。根據(jù)試驗形式也可分為試管法和平板法兩種。（一） 試管法（二） 平板法是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一。根據(jù)沉淀線的有無、形態(tài)和位置可作如下分析：抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計?？乖蚩贵w相對分子量的分析。抗原性質(zhì)的分析。抗體效價的滴定?？乖蚩贵w純度鑒定。免疫電泳的影響因素不包括電場強度溶液pH離子強度抗體純度電滲『正確答案』D『答案解析』免疫電泳的影響因素不包括抗體純度。單向擴(kuò)散試驗時錯誤的是將一定量的抗體混入瓊脂中每次測定必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線不必每次測定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線將抗原加入所打的孔中24?48小時看結(jié)果『正確答案』C『答案解析』單向擴(kuò)散試驗時錯誤的是：不必每次測定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗中，若抗原的含量比抗體多且分子量比抗體小，則沉淀線應(yīng)為靠近抗原孔，且弧線彎向抗原側(cè)靠近抗原孔，且弧線彎向抗體側(cè)靠近抗體孔，且弧線彎向抗原側(cè)靠近抗體孔，且弧線彎向抗體側(cè)居于抗原抗體孔中間，且弧線彎向抗原側(cè)『正確答案』D『答案解析』沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線如果靠近抗原孔，則表示抗體含量較大；沉淀線如果靠近抗體孔，則表示抗原含量較大；不出現(xiàn)沉淀線則表明無對應(yīng)的抗體或抗原或者抗原過量?？乖蚩贵w相對分子量的分析抗原或抗體