本科生《P》第三章載體

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》Professor,Dr.Degang

Zhao(趙德剛)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,

CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity

E-mail:dgzhao@

1

第三章基因工程載體教學(xué)目的與要求：1）掌握基因工程常用載體特點(diǎn)2）掌握基因克隆的基本方法2

第一節(jié)載體的定義

3載體（Vector）是指在寄主細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制，并能夠作為運(yùn)輸載體將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞的DNA分子。（ADNAmoleculethatiscapableofreplicationinahostorganism,andcanactasacarriermoleculefortheconstructionofrecombinantDNA.）基因克隆載體：能承載外源DNA帶入受體細(xì)胞，并在其中自我復(fù)制以維持和擴(kuò)增外源DNA的一類DNA分子，又稱為DNA克隆載體。基因表達(dá)載體Requireinavector:

CloningsitesOriginofreplicationSelectablemarkerSafety載體應(yīng)該具備記到主要條件，以pBR322為例進(jìn)行說明：1克隆位點(diǎn):在DNA分子合適的位置有1到多個(gè)克隆位點(diǎn)，可供外源DNA片段插入克隆載體DNA分子中。2復(fù)制起點(diǎn)：具有復(fù)制起點(diǎn)，外源DNA插入載體后，仍可由復(fù)制起點(diǎn)起始復(fù)制過程。3篩選標(biāo)記基因：具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因。4安全性：克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，且不能轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。pBR322為例說明負(fù)篩選法：首先用不含AP和TC的培養(yǎng)基，兩種都長，然后選取一些菌落，在含AP的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不長的，說明有外源基因插入AP位點(diǎn)，到不含AP和TC的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上找到相應(yīng)的點(diǎn)。第二節(jié)質(zhì)粒載體（Plasmidvectors）

6一、質(zhì)粒的定義質(zhì)粒（Plasmid）:

一種存在于細(xì)菌、酵母等寄主細(xì)胞中染色體外的裸露雙鏈DNA分子（acircularDNAmolecules,foundinnature,inbacteriaandsomeyeasts.pDNA）。大小一般可從1千多個(gè)堿基到100多kb，多數(shù)在10kb左右?？截悢?shù)：一個(gè)寄主細(xì)胞中某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)量之比。一般寄主細(xì)胞只有一套染色體。按照拷貝數(shù)的多少，可以將質(zhì)粒劃分為嚴(yán)緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒。當(dāng)拷貝數(shù)在1-10之間時(shí)，通常稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒。很多大質(zhì)粒是嚴(yán)緊型質(zhì)粒。當(dāng)拷貝數(shù)多于10個(gè)時(shí)，通常稱為松弛型質(zhì)粒，小質(zhì)粒一般是松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒之間沒有嚴(yán)格界限。某種質(zhì)粒對(duì)于某種寄主來說，拷貝數(shù)一般是一定的，拷貝數(shù)的存在是因?yàn)橘|(zhì)粒上存在cop基因，它可以指令寄主細(xì)胞合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)后，阻遏物也達(dá)到一定量，就阻遏質(zhì)粒進(jìn)一步復(fù)制。NumberofCopies：一個(gè)寄主細(xì)胞中某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)目的比值。Basedonthenumberofcopiesoftheplasmidfoundinthehostcell:lowcopynumberplasmids,stringent(嚴(yán)緊型)controlofDNAreplicationHighcopynumberplasmids,relaxedplasmid(松弛型)按照是否含有trans基因?qū)①|(zhì)粒分為結(jié)合型質(zhì)粒和非結(jié)合型質(zhì)粒。Trans基因是一種可以指令寄主細(xì)胞產(chǎn)生鞭毛，合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使寄主細(xì)胞與其他細(xì)胞相接合，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。我們把含有trans基因的質(zhì)粒稱為結(jié)合型質(zhì)粒，把不含有trans基因的質(zhì)粒稱為非結(jié)合型質(zhì)粒。在基因工程中我們一般選用什么樣的質(zhì)粒？松散型、非結(jié)合型

質(zhì)粒的命名：p，plasmid表示質(zhì)粒，隨后的兩三個(gè)大寫字母表示誰發(fā)現(xiàn)和發(fā)明了該質(zhì)粒，數(shù)字表示質(zhì)粒分離的次數(shù)或者構(gòu)建的一系列質(zhì)粒的編號(hào)。例：pBR322二、質(zhì)粒克隆載體質(zhì)粒經(jīng)改造后即可成為基因工程載體。如前述pBR322，載體需有克隆位點(diǎn)和標(biāo)記基因。標(biāo)記基因種類很多：1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr

，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:抗除草劑基因

2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）。主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化標(biāo)記基因。其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ,GUS,CAT。葡萄糖苷酸酶基因（GUS）該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒有這種基因。熒光素酶基因熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（Photobacterium

fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測(cè)定酶活。發(fā)光蛋白質(zhì)基因發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。

β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn):

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀

b.

lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大三、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略（Slightlymoreexoticplasmidvectors）1能在轉(zhuǎn)化的受體中進(jìn)行有效復(fù)制、有較多拷貝數(shù)（松弛型的質(zhì)粒ori）。2克隆位點(diǎn)：盡可能多一些，至少有一個(gè)?？捎肕CS連桿，MCS是指含多種內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite），又稱多聚接頭（polylinker）。3篩選標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源DNA插入時(shí)，標(biāo)記gene將失活而成為篩選的標(biāo)識(shí)。4構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)盡可能小。大于15kb的plasmid轉(zhuǎn)化效率明顯。5根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體組裝各種“元件”（小DNA片段）。如插入啟動(dòng)子，終止子。Puc18/19克隆載體：1.2.68kb2.ori來源于松弛型質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始位點(diǎn)，可在大腸桿菌E.ColiHB101,E.ColiC600等細(xì)胞中高效復(fù)制（DH5α）。3.含報(bào)告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。

PLacZα

LacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβpUC18

BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子pUC18/19中l(wèi)acZ序列篩選：lacZ來源于乳糖操縱子，含有啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和β-半乳糖苷酶的α-肽基因（lacZ）。該基因產(chǎn)物在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，菌落是藍(lán)的。陽性克?。ㄞD(zhuǎn)化子）是白色的。pUC系列質(zhì)粒載體由Messingetal.構(gòu)建，具有三個(gè)顯著特點(diǎn)：1.分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大2.易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα3.多克隆位點(diǎn)區(qū)

1)多克隆位點(diǎn)成對(duì)地存在于pUC18和pUC19中，位點(diǎn)排列順序相同，但方向相反,有利于外源DNA的克隆和定向插入

2)產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列:兩端限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’-突起端（EcoRI和HindⅢ),與之相鄰的兩個(gè)限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生3’-突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四個(gè)限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生5’-突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。pUCfamilyPolylinkerormultiplecloningsite[MCS]pUCm-T載體(pUCm-TVector):1線性化的載體，2載體每條鏈的3’端帶有一個(gè)突出的T。第三節(jié)大腸桿菌的噬菌體載體（BacteriophagevectorsforuseinE.Coli)一、噬菌體的定義（Whatarebacteriophages）噬菌體是吃細(xì)菌的病毒顆粒（viruses,“eaterofbacteria”）。CapsidtailGene3proteinCoatproteinDNAPhagesfallintothreemaingroups:

(1)tailless(2)headwithtail

(3)Filamentous（細(xì)絲狀）Geneticmaterial:(1)single-strandedRNA(2)double-strandedDNA病毒由DNA（orRNA）、外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行DNA（orRNA）復(fù)制和殼蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一種病毒中。噬菌體有嚴(yán)格的宿主專一性，限制了其作為載體使用的范圍。溫和噬菌體（Temperatephages

）：插入宿主染色體DNA→隨著宿主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制→溶原階段（LysogenicCycle）烈性噬菌體（Virulentphages）：不插入宿主染色體DNA→自主復(fù)制→溶菌階段（LyticCycle）二、λ噬菌體載體（Vectorsbasedonbacteriophageλ）1.λDNA的特點(diǎn)1)λDNA：λ噬菌體中的DNA，線狀，48.5kb，編碼46個(gè)基因，集中于頭部。2)cos位點(diǎn)：左右兩端各12個(gè)核苷酸組成的5’-粘性末端。兩者核苷酸序列互補(bǔ)，λDNA在包裝前是線狀的，在包裝后是環(huán)狀的。3）46gene：成簇排列。不是所有g(shù)ene都是生長必需的。

Capsidcomponents衣殼合成從A到J基因——左側(cè)區(qū)

Integration&excision分裂合成（陰影區(qū)為基因操作中非必需部位）

Early(late)regulation早、晚調(diào)節(jié)

DNAsynthesisDNA合成

Lysis

釋放4）有56種限制性核酸酶的酶切位點(diǎn)5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。LysisofcellandreleaseofmaturephageparticlesInductionLysogenic

responeCelldivisionLytic

responepSuchasultravioletlightAssembledorpackaged5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細(xì)胞→（溶菌階段）→cos位點(diǎn)連接→復(fù)制→在R和S蛋白作用下細(xì)胞破裂λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細(xì)胞→（溶原階段）→在宿主細(xì)胞int基因作用下插入宿主染色體→復(fù)制紫外線2.λ噬菌體作為克隆載體的依據(jù)①λ噬菌體溫和噬菌體，感染性高，易操作。②λ噬菌體可承載大的外源DNA?？沙休d的外源DNA為λDNA的75%-105%（即38-51kb）且λDNA上有20kb的區(qū)域?qū)Ζ耸删w并非必需，可取代或缺失。3.λ噬菌體載體類型λ噬菌體載體有兩種類型，即插入型載體（Insertionvectors）和替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）。1.插入型載體（Insertionvectors）：多用于cDNA構(gòu)建文庫。1）免疫功能失活型如λgt10，其左、右臂之間有一個(gè)CI基因，該基因應(yīng)用了imm434免疫區(qū)段。該區(qū)段完全時(shí)，出現(xiàn)渾濁的噬菌斑——λ噬菌體進(jìn)入溶菌階段；該區(qū)域被破壞時(shí)，CI基因失活，結(jié)果產(chǎn)生清晰的噬菌斑。可以通過形態(tài)學(xué)上的差異將兩者分開。2)β-半乳糖苷酶失活型如Charon16A，λgt11。2.替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）常用于基因組文庫構(gòu)建在左右臂之間有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的DNA序列將被替換掉。Stuffers和polystuffer區(qū)可以被替換掉。EMBL4：當(dāng)用兩端酶切位點(diǎn)時(shí)，中間也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌體片段退火。Charon40：中間含有多節(jié)段區(qū)（polystuffer），MCS是反向重復(fù)序列。兩者可容納外源DNA能力9-22kb之間。

使用替換型載體克隆外源DNA包括三個(gè)步驟：①用恰當(dāng)限制性酶消化λ載體，除去基因組中可替代的部分②將上述所得λDNA臂同外源DNA相連接③重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體圖3-8置換型載體組成示意圖圖3-9λEMBL3載體結(jié)構(gòu)示意圖Phagemids(phasmids):thephagefunctionsareexpressed,forexample,λZAPfamilybystrategene.二、凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體（Charonvector）是F.RBlattner在1977年在λ噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種特殊噬菌體載體。Charon：是古希臘神話中一名老擺渡工，專門負(fù)責(zé)在斯蒂克斯河（Riverstyx）上，運(yùn)送亡靈到陰間。

容納能力感染效率質(zhì)粒：nkb-nbp

低，0.1%轉(zhuǎn)化率

λ噬菌體：大片段，nkb-23kb高幾乎每個(gè)顆粒都有100%感染率圖3-11λGEM-II載體結(jié)構(gòu)示意圖三、M13噬菌體

M13噬菌體是一種絲狀（filamentous）噬菌體，內(nèi)含有環(huán)狀、單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）,長為6407個(gè)核苷酸，含DNA復(fù)制和噬菌體增殖所需的遺傳信息，可分為10個(gè)區(qū)。還有一個(gè)長507個(gè)核苷酸的基因間隔區(qū)（IS區(qū)），從第5489個(gè)核苷酸到第6005個(gè)核苷酸。M13的復(fù)制起點(diǎn)定位在基因間隔區(qū)內(nèi)，但I(xiàn)S區(qū)內(nèi)有些核苷酸序列即使發(fā)生突變、缺失或插入外源DNA，也不會(huì)影響M13DNA的復(fù)制，這為M13DNA構(gòu)建克隆載體提供了條件?？删幋a三類蛋白質(zhì)：復(fù)制蛋白質(zhì)（基因Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ）形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（基因Ⅰ，Ⅳ，Ⅺ）結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（基因Ⅲ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ）M13mp18M13噬菌體周期：①M(fèi)13噬菌體通過鞭毛吸附，感染雄性大腸桿菌，M13噬菌體的“+”鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以此為模板，復(fù)制互補(bǔ)的“-”鏈DNA。由此產(chǎn)生的雙鏈M13DNA稱為復(fù)制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般環(huán)狀雙鏈DNA進(jìn)行復(fù)制。②當(dāng)細(xì)胞內(nèi)RF-DNA達(dá)到近200個(gè)拷貝時(shí)，則RF-DNA中的“+”鏈DNA被單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，阻止“+”鏈DNA的復(fù)制合成。結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)只能以“-”鏈為模板不斷復(fù)制合成新的“+”鏈DNA。③新合成的“+”鏈DNA立即被積累在細(xì)胞內(nèi)的殼蛋白包裝成新的噬菌體顆粒，并不斷擠出宿主細(xì)胞。（單鏈，“+”鏈→存在于噬菌體中，雙鏈DNA存在于宿主細(xì)胞中。）M13噬菌體周期的特點(diǎn)：①增殖過程不會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的溶菌生長，被感染的細(xì)胞一個(gè)世代可以釋放1000個(gè)子代噬菌體。M13包裝DNA分子的能力可達(dá)M13DNA本身的6倍。②制備的M13DNA，單、雙鏈均可轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體細(xì)胞，因此M13DNA作為載體時(shí)，不必進(jìn)行體外包裝就可以直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。第四節(jié)原核生物應(yīng)用的其他載體一、cosmid質(zhì)粒載體①λ噬菌體特點(diǎn)：兩端部少于280bp，且含有cos位點(diǎn)，可以插入36.4-51kb長度的DNA；②質(zhì)?？寺≥d體特點(diǎn)：不用包裝即可轉(zhuǎn)導(dǎo)?？寺∧芰σ话悴怀^10kb，載體大小一般也在10kb以下，是環(huán)狀雙鏈DNA.cosmid質(zhì)粒載體特點(diǎn)：將λ噬菌體載體的cos位點(diǎn)和質(zhì)?？寺≥d體相結(jié)合，大約4-6kb長，能夠容納47kb的外源DNA。Cosmids:Thevector

bemadeupofplasmidsequencesjoinedtothecossitesofphageλ,about4-6kbinlength,canaccommodateclonedDNAfragmentsuptosome47kbinlength.二、噬菌粒載體M13噬菌粒載體（M13噬菌粒和質(zhì)粒）優(yōu)點(diǎn)是可以用來制備克隆基因的單鏈DNA。不足之處：A.插入外源片段后，遺傳穩(wěn)定性下降，外源DNA越大越嚴(yán)重。B．外源片段只按一種方向插入；C．接受外源DNA能力有限，小于1500bp。噬菌粒載體特點(diǎn)：A.分子量一般都比M13載體小，約3000bp，易于操作；B.可得到10kb的外源DNA單鏈序列；？C.有質(zhì)粒和噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，因此在大腸桿菌寄主中可以按正常雙鏈質(zhì)粒DNA分子形式復(fù)制；在有輔助噬菌體時(shí)可以按M13形式復(fù)制；D.可以從噬菌體直接測(cè)序。例：pMB1replicon（復(fù)制子）:①體外包裝，感染，質(zhì)粒型復(fù)制可容納外源DNA片段：30-45kb；②基因組文庫中使用。Genomemapping（酵母人工染色體亞克?。?。第五節(jié)真核細(xì)胞應(yīng)用的載體

1Ti

質(zhì)粒（Ti：Tumor-induce腫瘤誘發(fā)）根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium

tumefaciens)與Ti質(zhì)粒的G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征：1）不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng)；2）合成腫瘤特有的化合物—冠癭堿(opine)，能專一的為根癌農(nóng)桿菌所利用。這兩個(gè)特征由Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。Ti質(zhì)粒存在于根癌農(nóng)桿菌中，大小為90-150x106道爾頓,結(jié)構(gòu)是環(huán)狀雙鏈DNA,160-250kb，具六個(gè)功能區(qū)：①致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素；②冠癭堿（opine）合成區(qū)：參與冠癭堿合成；③冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解；④Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移；⑤毒（性）區(qū)：參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體；⑥D(zhuǎn)NA復(fù)制區(qū)：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制。Agrobacterium

oriOpinesynthesisT-DNALBRBCytokininsynthesisAuxinsynthesisVirulencegeneConstructionofTiplasmid合成氨基酸衍生物-冠癭堿Anxinsynthesisgene：合成細(xì)胞分裂素合成吲哚乙酸Cytokininsynthesisgene：Opinessynthesisgene：Ti質(zhì)粒類型（由Ti質(zhì)粒所產(chǎn)生的冠癭堿種類而定）有：①章魚堿類(octopine)；②胭脂堿類(nopaline)；③農(nóng)堿類(agropine)T-DNA

：Ti質(zhì)粒中與植物染色體結(jié)合的部位稱為T-DNA。T-DNA包括植物激素冠癭堿合成區(qū)基因及兩側(cè)相同的25bp重復(fù)序列，T-DNA整合不具特異性，右側(cè)25bp重復(fù)序列對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。2.Ti質(zhì)粒載體的中間載體（intermediatevector）Ti質(zhì)粒作為載體的問題：1）太大，不易轉(zhuǎn)化2）無適合克隆位點(diǎn)3）T-DNA致瘤區(qū)合成植物生長素和細(xì)胞分裂素，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞成瘤狀，不能成為完整植株Ti質(zhì)粒載體的中間載體由幾部分組成：A.適合E.Coli和A.Tumfaciens自主復(fù)制和選擇用標(biāo)記基因B.適合于植物細(xì)胞選用的標(biāo)記基因C.一段來自天然Ti質(zhì)粒的部分T-DNA序列（提供同源重組）D．1-2個(gè)來自T-DNA邊界的25bp重復(fù)序列E．用于表達(dá)外源基因的DNA序列（如啟動(dòng)子、終止子序列）Modified

TiplasmidDelete：

genesoftheproductionofbacterialfoodandofplanthormonesInsert：

selectablemarkergenepCAMBIA1301質(zhì)粒T-Border(right)Nos3’Gus35S5’NcoI35S5’Hyg(R)T-Border(left)35S3’HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLacZ植物根部羥基乙酰丁香酮乙酰丁香酮植物細(xì)胞單鏈-DNAFormationofcrowngall

植物根部受傷部位分泌乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酸誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒vir基因及根瘤菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上T-DNA單鏈切下根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物與單鏈T-DNA形成復(fù)合物復(fù)合物轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞

3．Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程T-DNAIntegratingtoplantgenomeT-DNAIntegratingtoplantgenome

二、酵母應(yīng)用的質(zhì)粒載體以大腸桿菌質(zhì)粒為基本骨架，具有酵母的DNA復(fù)制起始區(qū)，選擇標(biāo)記，有絲分裂穩(wěn)定區(qū)和外源DNA插入位點(diǎn)。Yeastepisomalplasmids（YEps

附加型質(zhì)粒）：在pBR322中插入酵母篩選標(biāo)記ura3和2μ質(zhì)粒DNA片段（復(fù)制起始部位和rep基因），拷貝數(shù)高，穩(wěn)定。以附加體形式在真核細(xì)胞中復(fù)制。（yeast2μplasmid,mayreplicateautonomouslyorintegrateintoachromosomallocation.）

Yeastintegrativeplasmids（YIps

綜合型整合質(zhì)粒）：含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因，但缺乏酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)，所以，它只有整合到酵母染色體中才能復(fù)制。（YipsaredesignedtointegrateintothechromosomeinasimilarwaytotheYepplasmid.）

Yeastreplicativep