生物工藝學基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DN聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。

基因工程工具酶

自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復制和修復等反應中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進而降解非己

DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具?；蚬こ坦ぞ呙富蚬こ坦ぞ呙讣捌鋺孟拗菩院怂醿?nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA連接酶—用于DNA和RNA的連接DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化其它酶類--用于生物細胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

限制性內(nèi)切酶的分類

限制性內(nèi)切酶的命名

限制性內(nèi)切酶的活性單位

限制性內(nèi)切酶的切割特點

限制性內(nèi)切酶的反應條件

限制性內(nèi)切酶的應用

一

.限制性內(nèi)切酶的概念核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）是從核酸的一端開始，一個接一個把核苷酸水解下來；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

細菌的限制—修飾作用1952年，Luria

和

Human，1953年，Bertani

和

Weigle

發(fā)現(xiàn)細菌的限制（restriction）現(xiàn)象：Phageλ（k）

E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染噬菌體侵染細菌噬菌體侵染細菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因為E.coliBphage對λ(K)進行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）R-M系統(tǒng)

細菌中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)

(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。細菌

R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解

DNA，為避免自身

DNA的降解，細菌可以修飾（甲基化酶）自身

DNA，未被修飾的外來

DNA則會被降解。

個別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和

Arber

從

E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ

1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans

因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細胞內(nèi)能夠識別雙鏈

DNA分子中的特定核苷酸序列，并對

DNA分子進行切割的一種酶。功能：降解不同源

DNA，而不降解同源

DNA。EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。

限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最適反應條件和溫度下，保溫1小時，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點在

DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割

DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個單鏈斷裂部位在

DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的

DNA片段，具有互補的單鏈延伸末端。識別序列

絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識別由4-8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點或靶序列。

識別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

ABB’A’

ABB’A’

或或EcoR

Ⅰ5‘……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

不同核酸內(nèi)切酶的特異識別位點PstⅠ5’……CTGCAG……3’

3’……GACGTC...…5’

AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用三、種酶切末端

平齊末端（如

SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’粘性末端（如

EcoR

Ⅰ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’

3’粘性末端（如

Pst

Ⅰ）同裂酶和同尾酶

同裂酶：來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。

如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。當胞嘧啶甲基化后，

MspⅠ不能再切割。

同尾酶：來源不同，識別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后

DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的

5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的

DNA片段可因粘性末端的互補而彼此再連接起來。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件1.底物

DNA

（1）DNA純度:RNA與

E結(jié)合影響有效酶濃度；

（2）DNA濃度:[DNA]過大，抑制酶活，影響酶分子擴散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

（3）識別位點及鄰近位點特異性序列

如：pBR322DNA有

4個

NarⅠ切點

(GGCGCC)其中

2個切點用1U酶水解

1h完全切開,2個切點用50U酶水解

16h水解不完全。

XmaⅢ

切點（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時不切割。（4）DNA二級/三級結(jié)構(gòu)

如：超螺旋

DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀

DNA需酶多（5）提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性

如：

高濃度

Hg2+、酚、

氯仿、乙醇、EDTA、

SDS、NaCl

等。

2.反應系統(tǒng)因素

（1）緩沖液（無菌、無污染）（2）金屬離子

如：Ⅱ型酶需

Mg2+，若以

Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）則特異性改變。

離子濃度不合適會抑制酶活。（3）牛血清蛋白

(BSA)

BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量

BSA會引起電泳拖尾。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件3.星活性

限制性內(nèi)切酶識別特異性放寬。

EcoRⅠ在正常情況下識別

GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過

5%，其識別位點發(fā)生松動，可在

AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識別能力叫做星活性，用

EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。

影響因素：甘油濃度

12-20%，酶與

DNA比例，離子強度，45%聚乙二醇

(PEG)，有機溶劑，8%二甲基亞楓，二價陽離子，12%乙醇。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件重組DNA前的切割

構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸內(nèi)切酶的應用重組DNA前的切割

構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸內(nèi)切酶的應用

甲基化酶分兩類：

維持性甲基化酶：用于在新合成的

DNA鏈上進行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的

DNA鏈上進行甲基化的酶。

用甲基化酶進行甲基化的作用封閉

DNA鏈中的某些識別位點，保護多余的限制性酶切位點。構(gòu)建新的酶切位點DNA連接酶（ligase）

能夠催化

DNA中相鄰的

3’-羥基和

5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵;T4DNA連接酶

可連接帶匹配粘性末端的

DNA分子，也可使平端的雙鏈

DNA分子相互連接。大腸桿菌

DNA連接酶

只能連接帶匹配粘末端的

DNA分子.ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′

5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′

5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶一.DNA的連接方法兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu).1.直接連結(jié)法---該法適用于:1)

同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端

重組DNA可用同種酶再切開2)不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端

i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產(chǎn)物與特定載體的連接

4)限制酶和其他方式產(chǎn)生的平末端.2.人工接頭連接法1)人工接頭（linker）的結(jié)構(gòu)

i.中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶識別位點

iii.某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保持同相.如:

八聚體d(GGAATTCC)

十聚體d(CGGAATTCCG)

十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火

ii.產(chǎn)生新的克隆位點

iii.合成匹配接頭3)連接方法

人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目的DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍

人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.3.匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點

i.

由兩個低聚核苷酸組成

ii.部分區(qū)域可以互補

iii.退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)

匹配接頭的種類

i.

預制匹配接頭(連接平端和粘性末端)

人工接頭+匹配接頭預制匹配接頭

ii.轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接頭退火轉(zhuǎn)換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉(zhuǎn)換匹配接頭

iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC.5.連接方法的選擇方法選擇的依據(jù):1)兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu)

2)DNA分子的限制酶譜

3)是否需要回收DNA片段連接方式的選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補齊,人工接頭

結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)載體加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能結(jié)合使用接頭不能不能第一選擇

3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇

(補齊后)

平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇二.DNA的連接反應

1.

連接反應理論當兩種DNA分子相連時,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān):1)

連接反應系統(tǒng)中的總DNA濃度i2)

一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j,該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化)3)

兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值.2.

連接反應條件

1)

評估連接反應結(jié)果的方法

i.

瓊脂糖凝膠電泳

ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化

2)

反應條件

i.

溫度

ii.ATP濃度

iii.時間

iv.連接酶濃度

v.克分子比率DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶

指在

DNA(或

RNA)模板指導下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物

3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。

DNA聚合酶在

DNA復制時起關(guān)鍵作用。

DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復，聚合酶Ⅲ參與DNA復制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。

DNA聚合酶Ⅰ和

Ⅲ的比較DNA聚合酶的特點：

①

需模板

(DNA或

RNA)；

②

需引物；

③

具有三種酶活性，即

5′→3′聚合酶活性；5′→3′外切酶活性和

3′→5′外切外切酶活性。DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶Ⅰ在DNA復制過程中的作用1、

5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶的三種活性DNA的切口平移（nicktranslation）

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。此時，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’

聚合酶活性同時發(fā)生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經(jīng)標記的核苷酸經(jīng)標記的核苷酸DNA雜交探針的制備5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個核苷酸(d)polⅠ將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動，形成32P標記的核苷酸合成的DNA鏈探針（probe）

探針：用來探知被測物存在的小

DNA或RNA叫做探針。

標記物：探針上結(jié)合有易被檢測的化合物稱為標記物。

分子雜交：探針

DNA或

RNA與被測物的互補結(jié)合叫做分子雜交（molecularhybridization）DNA聚合酶Ⅰ

來源

E.coli，由染色體

DNA基因編碼。商品上用的此酶來源于

PhageNM964整合的溶源性

E.coli。

結(jié)構(gòu)

一條多肽鏈，MW=109，000D。

活性

5′→3′聚合，3′→5′和

5′→3′外切。Klenow來源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段

(Klenow

和

Henningseon.1970DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端

(76kd)+N端（36kd）

Klenow

5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切Klenow

用途填補限制酶的

5′-粘性末端為平齊末端

5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’

3’…GGAATT5’

Klenow3′-末端標記

Klenow

在無底物時只進行

3′→

5′外切；有底物存在時則聚合。

這種標記也稱作交換標記，但

Klenow

作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶

來源：T4Phage感染的

E.coli

結(jié)構(gòu)：MW=114,000d

活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，對單鏈活性大于雙鏈DNA，外切酶活性比

Klenow

大

200倍

用途

填補或標記限制酶切后產(chǎn)生的

5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同

Klenow）3′-粘性末端的標記制備

DNA探針,同

Klenow

末端標記。

T7DNA聚合酶（測序酶）

來源：T7Phage感染的

E.coli

結(jié)構(gòu)：由

2個蛋白亞基組成：

T7phagegene5蛋白

+宿主硫氧蛋白

活性：

5′→3′聚合，持續(xù)反應時間最長，所以合成的

DNA鏈長。故在

DNA測序中很優(yōu)越。

3′→5′外切，是

DNA聚合酶Ⅰ的

1000倍。用途復制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列用填補或交換反應快速進行末端標記。

與

T４DNApol一樣，平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。5′3′3′5′修飾的

T7DNA聚合酶(測序酶)

來源：

天然

T７DNA聚合酶經(jīng)修飾處理

結(jié)構(gòu)：

同T７聚合酶。

用還原劑、分子氧、低濃度

Fe２+與酶保溫幾天，可使PhageT7gene5蛋白

N-端3′→5′外切酶活性中心失活

(O-修飾)。

即：5′→3′聚合酶作用提高，持續(xù)性長。3′→5′外切作用下降

99%以上。

TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)

來源：從耐熱細胞中純化，已有基因工程酶多種

結(jié)構(gòu)：單亞基

MW=94,000d。

活性：聚合最適溫度為

75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性

。

用途：PCR反應。測序，高溫下進行

DNA合成可減少模板二