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文檔簡介
第二章基因工程工具酶
基因工程的操作,是在分子水平上的操作,是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶,連接酶,DN聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割,拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對野生菌株(或真核生物如酵母)進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。
基因工程工具酶
自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝,在核酸復制和修復等反應中具有重要作用,有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進而降解非己
DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后,人類獲得了最好的基因工程工具?;蚬こ坦ぞ呙富蚬こ坦ぞ呙讣捌鋺孟拗菩院怂醿?nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA連接酶—用于DNA和RNA的連接DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化其它酶類--用于生物細胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)
限制性內(nèi)切酶的分類
限制性內(nèi)切酶的命名
限制性內(nèi)切酶的活性單位
限制性內(nèi)切酶的切割特點
限制性內(nèi)切酶的反應條件
限制性內(nèi)切酶的應用
一
.限制性內(nèi)切酶的概念核酸酶可分為兩類:核酸外切酶(exonuclease)是從核酸的一端開始,一個接一個把核苷酸水解下來;核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’,5’磷酸二酯鍵,將核酸鏈切斷。限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)
細菌的限制—修飾作用1952年,Luria
和
Human,1953年,Bertani
和
Weigle
發(fā)現(xiàn)細菌的限制(restriction)現(xiàn)象:Phageλ(k)
E.colikE.coli
B【E.coliB限制
λ(k)】感染不感染噬菌體侵染細菌噬菌體侵染細菌
仍有少量phageλ(K)可在
E.coliB中生存,是因為E.coliBphage對λ(K)進行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4(限制作用)10-4(限制作用)1(修飾作用)R-M系統(tǒng)
細菌中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶,構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)
(R-MRestriction-modificationsystem)。
R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。細菌
R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解
DNA,為避免自身
DNA的降解,細菌可以修飾(甲基化酶)自身
DNA,未被修飾的外來
DNA則會被降解。
個別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾,則可免予被降解。
限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和
Arber
從
E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ
1970Smith(美)在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber,H.O.Smith,Nathans
因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶):在細胞內(nèi)能夠識別雙鏈
DNA分子中的特定核苷酸序列,并對
DNA分子進行切割的一種酶。功能:降解不同源
DNA,而不降解同源
DNA。EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號
若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。
限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μLBuffer中,含1μg底物DNA,于最適反應條件和溫度下,保溫1小時,能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位,用U表示。buffer(pH=8.0):50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml(DDT:二硫蘇糖醇BSA:牛血清蛋白)限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點在
DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位,切割
DNA分子,產(chǎn)生鏈的斷裂。2個單鏈斷裂部位在
DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的
DNA片段,具有互補的單鏈延伸末端。識別序列
絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識別由4-8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識別序列內(nèi)切割DNA分子的,因此這些識別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點或靶序列。
識別序列有連續(xù)的(如GATC)和間斷的(如GANTC)兩種,它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’
A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’
ABB’A’
ABB’A’
或或EcoR
Ⅰ5‘……GAATTC……3’
3’……CTTAAG……5’
不同核酸內(nèi)切酶的特異識別位點PstⅠ5’……CTGCAG……3’
3’……GACGTC...…5’
AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用三、種酶切末端
平齊末端(如
SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ)
5’-GGCC-3’
3’-CCGG-5’
5’-GG--CC-3’
3’-CC--GG-5’
5’粘性末端(如
EcoR
Ⅰ)
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
5’-G--AATTC-3’
3’-CTTAA--G-5’
3’粘性末端(如
Pst
Ⅰ)同裂酶和同尾酶
同裂酶:來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割,形成同樣的末端。
如:HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。當胞嘧啶甲基化后,
MspⅠ不能再切割。
同尾酶:來源不同,識別的核苷酸靶序列也不相同,但切割后
DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
BamHⅠ5’-TGATCA-3’
3’-ACTAGT-5’
BclⅠ5’-AGATCT-3’
3’-TCTAGA-5’
BglⅡBamHⅠ
BclⅠ
BglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的
5’GATC粘性末端,由這種同尾酶產(chǎn)生的
DNA片段可因粘性末端的互補而彼此再連接起來。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件1.底物
DNA
(1)DNA純度:RNA與
E結(jié)合影響有效酶濃度;
(2)DNA濃度:[DNA]過大,抑制酶活,影響酶分子擴散
如:4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h
(3)識別位點及鄰近位點特異性序列
如:pBR322DNA有
4個
NarⅠ切點
(GGCGCC)其中
2個切點用1U酶水解
1h完全切開,2個切點用50U酶水解
16h水解不完全。
XmaⅢ
切點(CGGCCG)在GGCGGCCGCC時不切割。(4)DNA二級/三級結(jié)構(gòu)
如:超螺旋
DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀
DNA需酶多(5)提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性
如:
高濃度
Hg2+、酚、
氯仿、乙醇、EDTA、
SDS、NaCl
等。
2.反應系統(tǒng)因素
(1)緩沖液(無菌、無污染)(2)金屬離子
如:Ⅱ型酶需
Mg2+,若以
Mn2+代替Mg2+(如HindⅢ,EcoRI)則特異性改變。
離子濃度不合適會抑制酶活。(3)牛血清蛋白
(BSA)
BSA是酶穩(wěn)定劑,可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量
BSA會引起電泳拖尾。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件3.星活性
限制性內(nèi)切酶識別特異性放寬。
EcoRⅠ在正常情況下識別
GAATTC序列發(fā)生切割,但如果緩沖液中甘油濃度超過
5%,其識別位點發(fā)生松動,可在
AATT處發(fā)生切割,EcoRⅠ這種特殊的識別能力叫做星活性,用
EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點切割機率不等,降解不完全。
影響因素:甘油濃度
12-20%,酶與
DNA比例,離子強度,45%聚乙二醇
(PEG),有機溶劑,8%二甲基亞楓,二價陽離子,12%乙醇。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件重組DNA前的切割
構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交
用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針
亞克隆以用作序列分析基因定位,DNA同源性研究
限制性核酸內(nèi)切酶的應用重組DNA前的切割
構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交
用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針
亞克隆以用作序列分析基因定位,DNA同源性研究
限制性核酸內(nèi)切酶的應用
甲基化酶分兩類:
維持性甲基化酶:用于在新合成的
DNA鏈上進行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶:用于在非甲基化的
DNA鏈上進行甲基化的酶。
用甲基化酶進行甲基化的作用封閉
DNA鏈中的某些識別位點,保護多余的限制性酶切位點。構(gòu)建新的酶切位點DNA連接酶(ligase)
能夠催化
DNA中相鄰的
3’-羥基和
5’-磷酸基末端之間形成3′,5′-磷酸二酯鍵;T4DNA連接酶
可連接帶匹配粘性末端的
DNA分子,也可使平端的雙鏈
DNA分子相互連接。大腸桿菌
DNA連接酶
只能連接帶匹配粘末端的
DNA分子.ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′
5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′AATTC······GG······CTTAA5′
5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶一.DNA的連接方法兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu).1.直接連結(jié)法---該法適用于:1)
同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端
重組DNA可用同種酶再切開2)不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端
i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產(chǎn)物與特定載體的連接
4)限制酶和其他方式產(chǎn)生的平末端.2.人工接頭連接法1)人工接頭(linker)的結(jié)構(gòu)
i.中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶識別位點
iii.某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保持同相.如:
八聚體d(GGAATTCC)
十聚體d(CGGAATTCCG)
十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途
i.平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火
ii.產(chǎn)生新的克隆位點
iii.合成匹配接頭3)連接方法
人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目的DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍
人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連.3.匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)
匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點
i.
由兩個低聚核苷酸組成
ii.部分區(qū)域可以互補
iii.退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)
匹配接頭的種類
i.
預制匹配接頭(連接平端和粘性末端)
人工接頭+匹配接頭預制匹配接頭
ii.轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)
二匹配接頭退火轉(zhuǎn)換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉(zhuǎn)換匹配接頭
iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC.5.連接方法的選擇方法選擇的依據(jù):1)兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu)
2)DNA分子的限制酶譜
3)是否需要回收DNA片段連接方式的選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補齊,人工接頭
結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)載體加尾外切酶
5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能
5’-突起非相容5’-突起不能結(jié)合使用接頭不能不能第一選擇
3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能
3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端
3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇
(補齊后)
平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇二.DNA的連接反應
1.
連接反應理論當兩種DNA分子相連時,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān):1)
連接反應系統(tǒng)中的總DNA濃度i2)
一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j,該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化)3)
兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值.2.
連接反應條件
1)
評估連接反應結(jié)果的方法
i.
瓊脂糖凝膠電泳
ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化
2)
反應條件
i.
溫度
ii.ATP濃度
iii.時間
iv.連接酶濃度
v.克分子比率DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA聚合酶
指在
DNA(或
RNA)模板指導下,以4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)為底物,在引物
3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。
DNA聚合酶在
DNA復制時起關(guān)鍵作用。
DNA聚合酶主要有三類:聚合酶Ⅰ(polⅠ),聚合酶Ⅱ(polⅡ),聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復,聚合酶Ⅲ參與DNA復制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
DNA聚合酶Ⅰ和
Ⅲ的比較DNA聚合酶的特點:
①
需模板
(DNA或
RNA);
②
需引物;
③
具有三種酶活性,即
5′→3′聚合酶活性;5′→3′外切酶活性和
3′→5′外切外切酶活性。DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA聚合酶Ⅰ在DNA復制過程中的作用1、
5′→3′聚合酶活性:
CCGGGCTATCGGE.coli
DNApolIMg2+,4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性
3、3′→5′外切酶活性
GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli
DNApolIMg2++pC,pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli
DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC,pG,pC5′DNA聚合酶的三種活性DNA的切口平移(nicktranslation)
DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過DNA缺口平移,制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。此時,DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’
聚合酶活性同時發(fā)生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經(jīng)標記的核苷酸經(jīng)標記的核苷酸DNA雜交探針的制備5‘
3’
3‘
5’
5‘
3’
3‘
5’
5‘
3’
3‘
5’
5‘
3’
3‘
5’
5‘
3’
3‘
5’
********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個核苷酸(d)polⅠ將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(c)(d)的步驟,缺口沿5’-3‘方向移動,形成32P標記的核苷酸合成的DNA鏈探針(probe)
探針:用來探知被測物存在的小
DNA或RNA叫做探針。
標記物:探針上結(jié)合有易被檢測的化合物稱為標記物。
分子雜交:探針
DNA或
RNA與被測物的互補結(jié)合叫做分子雜交(molecularhybridization)DNA聚合酶Ⅰ
來源
E.coli,由染色體
DNA基因編碼。商品上用的此酶來源于
PhageNM964整合的溶源性
E.coli。
結(jié)構(gòu)
一條多肽鏈,MW=109,000D。
活性
5′→3′聚合,3′→5′和
5′→3′外切。Klenow來源:
E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段
(Klenow
和
Henningseon.1970DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端
(76kd)+N端(36kd)
Klenow
5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切Klenow
用途填補限制酶的
5′-粘性末端為平齊末端
5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’
3’…GGAATT5’
Klenow3′-末端標記
Klenow
在無底物時只進行
3′→
5′外切;有底物存在時則聚合。
這種標記也稱作交換標記,但
Klenow
作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶
來源:T4Phage感染的
E.coli
結(jié)構(gòu):MW=114,000d
活性:
5′→3′聚合活性;
3′→5′外切活性,對單鏈活性大于雙鏈DNA,外切酶活性比
Klenow
大
200倍
用途
填補或標記限制酶切后產(chǎn)生的
5′-粘性末端的3′-凹缺末端。(同
Klenow)3′-粘性末端的標記制備
DNA探針,同
Klenow
末端標記。
T7DNA聚合酶(測序酶)
來源:T7Phage感染的
E.coli
結(jié)構(gòu):由
2個蛋白亞基組成:
T7phagegene5蛋白
+宿主硫氧蛋白
活性:
5′→3′聚合,持續(xù)反應時間最長,所以合成的
DNA鏈長。故在
DNA測序中很優(yōu)越。
3′→5′外切,是
DNA聚合酶Ⅰ的
1000倍。用途復制較長的模板,在測序中可讀出較長的序列用填補或交換反應快速進行末端標記。
與
T4DNApol一樣,平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。5′3′3′5′修飾的
T7DNA聚合酶(測序酶)
來源:
天然
T7DNA聚合酶經(jīng)修飾處理
結(jié)構(gòu):
同T7聚合酶。
用還原劑、分子氧、低濃度
Fe2+與酶保溫幾天,可使PhageT7gene5蛋白
N-端3′→5′外切酶活性中心失活
(O-修飾)。
即:5′→3′聚合酶作用提高,持續(xù)性長。3′→5′外切作用下降
99%以上。
TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)
來源:從耐熱細胞中純化,已有基因工程酶多種
結(jié)構(gòu):單亞基
MW=94,000d。
活性:聚合最適溫度為
75-80℃,不具3′→5′外切酶活性,具5′→3′外切活性
。
用途:PCR反應。測序,高溫下進行
DNA合成可減少模板二
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