有機(jī)試劑5,熒光試劑

第五章熒光試劑熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展熒光產(chǎn)生的理論基礎(chǔ)分子熒光光譜熒光強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命有機(jī)試劑結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系代表性熒光試劑熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展十六世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)熒光的產(chǎn)生原理和條件1852年Stokes考察奎寧和葉綠素?zé)晒獍l(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)要長(zhǎng)，認(rèn)定是物質(zhì)吸收光后重新發(fā)射出的光，，提出了“熒光”1867Goppetsroder桑色素?zé)晒鈾z測(cè)鋁二十世紀(jì)初，已熒光素、稠環(huán)芳烴及曙紅等600余種化合物有熒光1924年Wawwillous測(cè)定熒光產(chǎn)率1926年Gavila對(duì)熒光壽命進(jìn)行了測(cè)定熒光產(chǎn)生的理論基礎(chǔ)基態(tài)和激發(fā)態(tài)單重態(tài)（S)和三重態(tài)(T)熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜λem>λex

斯托克斯（stokes）位移熒光強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命熒光強(qiáng)度

F=2.3ФFIoεbc

F—熒光強(qiáng)度；ФF—熒光量子產(chǎn)率，Io—照射到被測(cè)物質(zhì)上的光強(qiáng)度；ε—該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)；b—檢測(cè)池厚度；c—物質(zhì)濃度

熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度的區(qū)別熒光量子產(chǎn)率是熒光物質(zhì)的固有屬性其與物質(zhì)濃度無關(guān)熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度有密切關(guān)系同濃度下，熒光量子產(chǎn)率高的熒光越強(qiáng)（排出外界條件影響）熒光壽命熒光壽命（τ）

lnFo-lnFτ=-t/τ

Fo和Fτ分別代表t=0和t=τ時(shí)的熒光強(qiáng)度，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)量不同時(shí)間的Ft值，確定lnFt—t的關(guān)系曲線，應(yīng)為直線直線斜率就是熒光壽命用式子τ=10-5/εmax估計(jì)熒光壽命，εmax為最大吸收波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù)，如S0-S1躍遷的ε值一般為103，估計(jì)熒光壽命是10-8s.影響有機(jī)化合物熒光的有機(jī)試劑結(jié)構(gòu)因素分子共軛體系共軛大π鍵共平面程度及其剛性.取代基影響雜原子影響分子離子化對(duì)熒光的影響立體結(jié)構(gòu)分子共軛體系大小對(duì)熒光的影響

有機(jī)熒光團(tuán)能發(fā)射出熒光的共軛π鍵的基團(tuán)（-CH=CH-）n（n>2），苯，萘，對(duì)苯二醌，苯并雜環(huán)、吡喃酮以及占噸酮基團(tuán)共軛體系越大，熒光量子強(qiáng)度越高對(duì)于稠環(huán)芳烴，具有相同芳香環(huán)數(shù)的化合物，芳環(huán)的連接和排列順序不同，化合物的有關(guān)熒光性能也不同芳環(huán)直線性排列的化合物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)比非線性排列的波長(zhǎng)要長(zhǎng)芳香環(huán)數(shù)越多，共軛體系越大，熒光越強(qiáng)芳香環(huán)或共軛體系增加到一定程度，只是熒光發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波紅移，ФF不再增加，還可能降低共軛大π鍵共平面及其剛性的影響

有機(jī)分子具有共軛平面結(jié)構(gòu)才顯示出熒光特性分子的共軛體系必須具備共平面性共軛體系的平面結(jié)構(gòu)還要有一定程度的剛性取代基的影響

取代基種類的影響取代基有推電子取代基和吸電子取代基推電子取代基：-NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OR（R=-CH3、-C2H5等吸電子取代基：C=O、-NO2，-COOH，-CHO、-COR（R=-CH3，-C2H5等）、-N=N-、鹵素（-F，Cl，Br，I）等推電子取代基增強(qiáng)熒光推電子取代基增強(qiáng)熒光取代基中O或N上的孤對(duì)電子參與有機(jī)熒光分子的共軛大π鍵，擴(kuò)大共軛體系波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度明顯增加極性溶劑中易形成氫鍵，強(qiáng)酸中易質(zhì)子化，堿性介質(zhì)中可離解出H質(zhì)子化試劑分子帶正電，使熒光減弱離解出H試劑分子帶負(fù)電荷，熒光增強(qiáng)

吸電子取代基減弱熒光類取代基中的n電子躍遷到π*屬于禁阻躍遷，激發(fā)態(tài)分子數(shù)較少

S1－T1的體系間跨越占優(yōu)勢(shì)，激發(fā)態(tài)分子放出光子的數(shù)大為減少，使熒光減弱－CN氰基（-C≡N）是不飽和取代基，它應(yīng)使取代的化合物熒光減弱，但實(shí)際結(jié)果是表現(xiàn)出推電子的效果—熒光增強(qiáng)－F雖是吸電子取代基，但增強(qiáng)熒光磺酸基含有不飽和鍵，表現(xiàn)出吸電子性能，應(yīng)減弱熒光但它易離解出H帶負(fù)電荷，又體現(xiàn)出推電子的行為，使熒光增加增減相低，磺酸根的引入一般無顯著熒光變化，最明顯的是試劑水溶性的增加取代基數(shù)量及其所處位置的影響

對(duì)于不同的發(fā)光母體，同類取代基所處位置不同所表達(dá)的熒光強(qiáng)弱變化規(guī)律也不相同小體積取代基所貢獻(xiàn)的共軛效應(yīng)小只是體現(xiàn)出其電荷影響大的取代基如苯或乙炔基苯，其共軛效應(yīng)大，取代后擴(kuò)大共軛體系，熒光增強(qiáng)的效應(yīng)大于其吸電子使熒光減弱的效應(yīng)結(jié)果是取代后的熒光強(qiáng)度不是減弱而是大大增強(qiáng)兩類取代基共同作用推電子基和吸電子基共存時(shí)，推電子基結(jié)合在對(duì)于吸電子基共振電子密度減小的原子上，構(gòu)成熒光性7-羥基香豆素（ФF=0.37）6-和8-羥基取代香豆素?zé)o熒光4-甲基-7-羥基香豆素則因甲基的超共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)（ФF=0.41）兩個(gè)以上推電子基同時(shí)取代，化合物的熒光會(huì)受到抑制如甲氧基苯的ФF是0.291，4-二甲氧基苯的ФF是0.21，再如甲苯的ФF是0.17對(duì)甲酚的ФF等于0.09，（取代基）加重效應(yīng)對(duì)熒光的影響

加重效應(yīng)減弱熒光ФF是0.22，ФP（磷光量子產(chǎn)率）是0.14ФF等于10-5，ФP變?yōu)?.43芳香環(huán)中雜原子的影響

增強(qiáng)或減弱熒光，看雜原子化合物結(jié)構(gòu)吡咯、噻吩及呋喃熒光量子產(chǎn)率很小，苯并后的吲哚、硫茚及苯并呋喃熒光大大增強(qiáng)n——π*躍遷變?yōu)棣小?躍遷問題：從分子結(jié)構(gòu)和光譜特性討論有機(jī)顯色劑和熒光試劑的聯(lián)系與區(qū)別。ФF0.86ФF約1.0ФF0.90.分子離子化對(duì)熒光的影響分子離子化對(duì)熒光影響很大*熒光試劑在不同酸度下離子化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度大小不同*選擇適宜條件，使試劑有最大熒光強(qiáng)度，以便于高靈敏檢測(cè)

分子的立體結(jié)構(gòu)也影響熒光1，2-二苯乙烯反式具有較強(qiáng)的熒光，順式則無熒光無機(jī)離子的主要有機(jī)熒光試劑鈣黃綠素類似物2，2-ˊ二羥基偶氮苯同系物西夫堿和腙類.2-羥基-1-萘甲醛縮氨基硫脲0.03-0.7μgGa/ml，λex/λem=412nm/470nm3-羥基皮考啉醛縮-2-吡啶腙（38）在pH4.7熒光測(cè)定Al3+，檢測(cè)限小于2ng芐基-2-吡啶酮-2-喹啉腙（37）可以熒光測(cè)定10ng的鋅8-羥基喹啉（HQ）和8-羥基喹啉-5-磺酸（HQS

β-二酮類

黃酮類

蒽醌類三苯甲烷占噸酮類酸性化合物1.熒光素同系物曙紅和二溴熒光素2.苯芴酮同系物堿性化合物羅丹明6G>丁級(jí)羅丹明B>羅丹明4G>羅丹明3B>羅丹明B還有卟啉某些無機(jī)陰離子和小分子的熒光試劑測(cè)定亞硝酸根2，3-二氨基萘1，2-二氨基-5，7-萘二磺酸

λex/λem=298nm/429nm，不需萃取，檢測(cè)限達(dá)到0.09ng/ml2，3-二氨基萘與Se（IV）形成硒唑測(cè)硒，λex/λem=366nm/520、560nm，測(cè)定范圍0.4-6.0ng/ml與NO形成熒光素三氮唑檢測(cè)生物體內(nèi)的NO，檢測(cè)限為5nmol/L檢測(cè)限1μmol/L2-苯乙酰-1，3-茚滿二酮-1-腙（2-DBIH）測(cè)定溴氧（O3）的熒光試劑，基于在三氯甲烷中溴氧與1，2-二-（4-吡啶基）乙烯反應(yīng)生成4-甲?；拎?，4-甲?；拎づc2-DBIH反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物，λex/λem=468nm/536nm，檢測(cè)限0.02μg*在過氧化酶的存在下，過氧化氫（H2O2）氧化7-羥基-6-甲氧基香豆素（莨菪亭，58）并使其熒光下降，據(jù)此可以測(cè)定H2O2，檢測(cè)限10-10mol[118].還原劑會(huì)影響這一反應(yīng)的進(jìn)行*在微堿性（pH7.2）溶液中，有過氧化酶存在，H2O2會(huì)氧化二乙酰二氯二氫熒光素為強(qiáng)熒光的化合物，用于測(cè)定2×10-11-3×10-10mol/ml[

*熒光素-乙酸汞在堿性溶液中具有熒光，λex/λem=499nm/520nm，加入S2-后，熒光減弱，可測(cè)定微量硫*四氯熒光素汞化合物也用于測(cè)定硫化物測(cè)定某些有機(jī)物、藥物等的熒光試劑蒽酮測(cè)定丙三醇λex/λem488nm/575nm，測(cè)定10-75μg丙三醇在濃H2SO4中脫水成丙烯醛水楊醛與肼反應(yīng)生成的席夫堿水楊醛縮連氮，測(cè)定肼脫氫抗壞血酸與鄰苯二胺反應(yīng)生成具有藍(lán)