第一章紫外-可見分光光度分析法

第一章

紫外-可見分光光度分析法一、概述二、紫外可見吸收光譜三、分子吸收光譜與電子躍遷四、光的吸收定律第一節(jié)

基本原理一、概述

基于物質光化學性質而建立起來的分析方法稱之為光化學分析法。分為:光譜分析法和非光譜分析法。光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質產生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強度來進行分析的方法。

吸收光譜分析發(fā)射光譜分析分子光譜分析原子光譜分析概述:

在光譜分析中，依據物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結構鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結構鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質的定量分析。本章主要講授紫外可見吸光光度法。二、紫外可見吸收光譜1．光的基本性質

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長、頻率、光速c、波數（cm-1）等參數來描述：

=c；波數=1/=/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數：h=6.626×10-34J×S)光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm遠紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）

2.物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;分子結構的復雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；用不同波長的單色光照射，測吸光度—吸收曲線與最大吸收波長

max；M+

h

M*光的互補：藍黃基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2吸收曲線的討論：（1）同一種物質對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（動畫）（3）吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據之一。（4）不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據。3.紫外—可見分子吸收光譜與電子躍遷物質分子內部三種運動形式：

（1）電子相對于原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉動分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量分子的內能：電子能量Ee、振動能量Ev

、轉動能量Er即E＝Ee+Ev+ErΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

能級躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉動能級間躍遷產生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。討論：（1）轉動能級間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉動光譜；（2）振動能級的能量差ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；（3）電子能級的能量差ΔEe較大1～20eV。電子躍遷產生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜討論：

（4）吸收光譜的波長分布是由產生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內部能級分布狀況，是物質定性的依據。（5）吸收譜帶強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關，也提供分子結構的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數εmax也作為定性的依據。不同物質的λmax有時可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數成正比，定量分析的依據。三、分子吸收光譜與電子躍遷1．紫外—可見吸收光譜

有機化合物的紫外—可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結果（三種）：σ電子、π電子、n電子。分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

⑴σ→σ＊躍遷

所需能量最大，σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)(吸收波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λ為125nm,乙烷λmax為135nm。⑵n→σ＊躍遷

所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λ分別為173nm、183nm和227nm。⑶π→π＊躍遷

所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，摩爾吸光系數εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，屬于強吸收。不飽和烴、共軛烯烴和芳香烴類均可發(fā)生該類躍遷。如：乙烯π→π*躍遷的λ為162nm，

εmax為:1×104L·mol-1·cm－1。⑷n→π＊躍遷

需能量最低，吸收波長λ>200nm。這類躍遷在躍遷選律上屬于禁阻躍遷，摩爾吸光系數一般為10～100L·mol-1·cm-1，吸收譜帶強度較弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊

躍遷。丙酮n→π＊躍遷的λ為275nmεmax為22L·mol-1·cm-1（溶劑環(huán)己烷)。生色團與助色團生色團：

最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產生的。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。助色團：

有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。紅移與藍移

有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發(fā)生變化:

λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。吸收強度即摩爾吸光系數ε增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應或減色效應，如圖所示。2.金屬配合物的紫外—可見吸收光譜

金屬離子與配位體反應生成配合物的顏色一般不同于游離金屬離子(水合離子)和配位體本身的顏色。金屬配合物的生色機理主要有三種類型：⑴配位體微擾的金屬離子d一d電子躍遷和ｆ一ｆ電子躍遷

摩爾吸收系數ε很小，對定量分析意義不大。⑵金屬離子微擾的配位體內電子躍遷

金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長和強度的變化。變化與成鍵性質有關，若靜電引力結合，變化一般很小。若共價鍵和配位鍵結合，則變化非常明顯。⑶電荷轉移吸收光譜在分光光度法中具有重要意義。電荷轉移吸收光譜

當吸收紫外可見輻射后，分子中原定域在金屬M軌道上電荷的轉移到配位體L的軌道，或按相反方向轉移，這種躍遷稱為電荷轉移躍遷，所產生的吸收光譜稱為荷移光譜。

電荷轉移躍遷本質上屬于分子內氧化還原反應，因此呈現(xiàn)荷移光譜的必要條件是構成分子的二組分，一個為電子給予體，另一個應為電子接受體。電荷轉移躍遷在躍遷選律上屬于允許躍遷，其摩爾吸光系數一般都較大(104左右)，適宜于微量金屬的檢出和測定。

電荷轉移躍遷在紫外區(qū)或可見光呈現(xiàn)荷移光譜，荷移光譜的最大吸收波長及吸收強度與電荷轉移的難易程度有關。

例：Fe3＋與SCN－形成血紅色配合物，在490nm處有強吸收峰。其實質是發(fā)生了如下反應：

[Fe3＋SCN－

]

＋hν=[FeSCN]2＋

四、光的吸收定律

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。A∝b

（動畫1）（動畫2）

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。A∝c

二者的結合稱為朗伯—比耳定律，其數學表達式為：

朗伯—比耳定律數學表達式

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關系為：

a=ε/M（M為摩爾質量）透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關系:

A＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的依據。應用于各種光度法的吸收測量；

摩爾吸光系數ε在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數a(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。2.摩爾吸光系數ε的討論

（1）吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數；

（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；（3）可作為定性鑒定的參數；

（4）同一吸收物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度。

摩爾吸光系數ε的討論（5）εmax越大表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104：高靈敏；

ε<2×104：不靈敏。（6）ε在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。3.偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素。（1）物理性因素難以獲得真正的純單色光。朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

非單色光作為入射光引起的偏離

假設由波長為λ1和λ2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

A

1＝lg（Ｉo1/Ｉt1）＝ε1bc

A

2＝lg(Ｉo2/Ｉt2）＝ε2bc故：式中：Ｉo1、Ｉo2分別為λ1、λ2的入射光強度；

Ｉt1、Ｉt2分別為λ1、λ2的透射光強度；

ε1、ε2分別為λ1、λ2的摩爾吸光系數；因實際上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故

A總＝lg（Ｉo總/Ｉt總)＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉt1+Ｉt2）

＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉo110-ε1bc

+Ｉo210-ε2bc

）令：ε1-ε2＝；設：Ｉo1＝Ｉo2A總＝lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10-εbc

）

＝

A1+lg2-lg(1＋10-εbc

)

討論:

因實際上只能測總吸光度A總，并不能分別測得A1和A2，故：討論:

A總=A1+lg2-lg(1＋10－εbc

)

(1)=0；即：

1=

2=

則：

A總

＝lg（Ｉo/Ｉt）＝bc(2)

≠0

若

<0；即

2<

1；－

bc>0,

lg(1＋10

bc)值隨c值增大而增大，則標準曲線偏離直線向c軸彎曲，即負偏離；反之，則向A軸彎曲，即正偏離。討論:

A總=A1+lg2-lg(1＋10－εbc

)

(3)｜｜很小時，即ε1≈ε2：

可近似認為是單色光。在低濃度范圍內，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使｜｜很小，A總

≠Ａ1，且隨著c值增大，

A總

與A1的差異愈大，在圖上則表現(xiàn)為A—c曲線上部(高濃度區(qū))彎曲愈嚴重。故朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

(4)為克服非單色光引起的偏離，首先應選擇比較好的單色器。此外還應將入射波長選定在待測物質的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。(2)化學性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當溶液濃度c>10－2mol/L時，吸光質點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構、配合物的形成等化學平衡時。使吸光質點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質也不相同。故此時溶液pH對測定有重要影響。請選擇內容：第一節(jié)基本原理第二節(jié)紫外-可見分光光度計第三節(jié)顯色與測量條件的選擇第四節(jié)分光光度測定方法第五節(jié)有機合物紫外光譜解析結束第五章

紫外吸收光譜分析法一、基本組成generalprocess二、分光光度計的類型typesofspectrometer

第二節(jié)

紫外—可見分光光度計ultravioletspectrometryultravioletspectrometer儀器紫外-可見分光光度計一、基本組成

generalprocess光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。

2.單色器

將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理二、分光光度計的類型

typesofspectrometer

1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束

自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產生交流信號。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數光譜。光路圖請選擇內容：第一節(jié)紫外吸收光譜基本原理principlesofultravioletspectrometry第二節(jié)紫外可見分光光度計ultravioletspectrometer第三節(jié)紫外吸收光譜的應用applicationofultravioletspectrometry結束第五章

紫外-可見分光光度法一、顯色反應的選擇二、顯色反應條件的選擇三、共存離子干擾的消除四、測定條件的選擇五、提高光度測定靈敏度和選擇性的途徑第三節(jié)

顯色與測量條件的選擇一、顯色反應的選擇1.選擇顯色反應時，應考慮的因素

靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測定波長處無明顯吸收，兩種有色物最大吸收波長之差：“對比度”，要求△>60nm。2.配位顯色反應

當金屬離子與有機顯色劑形成配合物時，通常會發(fā)生電荷轉移躍遷，產生很強的紫外—可見吸收光譜。3.氧化還原顯色反應

某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強烈吸收，可利用氧化還原反應對待測離子進行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋+10SO42-＋16H+將Mn2＋

氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進行測定。4.顯色劑無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。有機顯色劑：種類繁多

偶氮類顯色劑：本身是有色物質，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。

三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等二、顯色反應條件的選擇1.顯色劑用量吸光度A與顯色劑用量CR的關系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.反應體系的酸度

在相同實驗條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的pH范圍。3.顯色時間與溫度

實驗確定4.溶劑一般盡量采用水相測定，三、共存離子干擾的消除1.加入掩蔽劑

選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產物不干擾待測組分的測定。例：測定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為Fe(PO４)23-(無色)，消除Fe3+的干擾；又如用鉻天菁S光度法測定Al3+時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，消除Fe3+的干擾。2.選擇適當的顯色反應條件3.分離干擾離子四、測定條件的選擇1.選擇適當的入射波長

一般應該選擇λmax為入射光波長。如果λmax處有共存組分干擾時，則應考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。

2.選擇合適的參比溶液

為什么需要使用參比溶液？

測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強度。參比溶液的選擇一般遵循以下原則：

⑴若僅待測組分與顯色劑反應產物在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純溶劑（水)作參比溶液；⑵若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；參比溶液的選擇一般遵循以下原則：

⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；

⑷若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。3.控制適宜的吸光度（讀數范圍）

不同的透光度讀數，產生的誤差大小不同：－lgT=εbc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434T-1dT=εbdc兩式相除得：

dc/c=（0.434/TlgT）dT

以有限值表示可得：

Δc/c=（0.434/TlgT）ΔT

濃度測量值的相對誤差（Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關，而且與其透光度讀數T的值也有關。是否存在最佳讀數范圍？何值時誤差最?。?/p>

最佳讀數范圍與最佳值

設：ΔT=1%，則可繪出溶液濃度相對誤差Δc/c與其透光度T的關系曲線。如圖所示：當：ΔT=1%，T在20%～65%之間時，濃度相對誤差較小，最佳讀數范圍。

可求出濃度相對誤差最小時的透光度Tmin為：

Tmin＝36.8%,Amin＝0.434

用儀器測定時應盡量使溶液透光度值在T%=20～65%(吸光度A=0.70～0.20)。五、提高光度測定靈敏度和選擇性的途徑1.合成新的高靈敏度有機顯色劑2.采用分離富集和測定相結合3.采用三元(多元)配合物顯色體系

由一個中心金屬離子與兩種(或兩種以上)不同配位體形成的配合物，稱為三元(多元)配合物。多元配合物顯色反應具有很高的靈敏度，一方面是因為多元配合物比其相應的二元配合物分子截面積更大；另一方面是因為第二或第三配位體的引入，可能產生配位體之間、配位體與中心金屬離子間的協(xié)同作用，使共軛π電子的流動性和電子躍遷幾率增大。三元配合物主要類型有：三元離子締合物、三元混配配合物、三元膠束(增溶)配合物。請選擇內容：第一節(jié)基本原理第二節(jié)紫外-可見分光光度計第三節(jié)顯色與測量條件的選擇第四節(jié)分光光度測定方法第五節(jié)有機合物紫外光譜解析結束第五章

紫外-可見分光光度法一、普通分光光度法二、示差分光光度法三、雙波長分光光度法四、導數分光光度法第四節(jié)

分光光度測定方法一、普通分光光度法1.單組分的測定

通常采用A-C

標準曲線法定量測定。2.多組分的同時測定

⑴若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進行測定。這本質上與單組分測定沒有區(qū)別。

⑵若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。Aλ1=εaλ1bca＋εbλ1bcb

Aλ2=εaλ2bca＋εbλ2bcb

二、示差分光光度法（示差法）

普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量較高時，將產生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。

設：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=εb

cx

As=εbcsΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx－cs）=εbΔc

測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差ΔＡ。示差分光光度法（示差法）

ΔA＝Ax－As=εb(cx－cs）=εbΔc

測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差ΔA

。

示差法測得的吸光度與Δc呈直線關系。由標準曲線上查得相應的Δc值，則待測溶液濃度cx

：

cx=cs+Δc

示差法標尺擴展原理：普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做參比，調T=100%則：cx的T=50%；標尺擴展10倍三、雙波長分光光度法

不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長λ1處的吸光度Aλ1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。

ΔA

＝Aλ2－Aλ1＝(ελ2－ελ1)bc

兩波長處測得的吸光度差值ΔA與待測組分濃度成正比。ελ1和ελ2分別表示待測組分在λ1和λ2處的摩爾吸光系數。

關鍵問題:測量波長λ2和參比波長λ1的選擇與組合

以兩組分x和y的雙波長法測定為例：設：x為待測組分，y為干擾組分，二者的吸光度差分別為:

ΔAx和ΔAy，則該體系的總吸光度差ΔAx+y為：