細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)操作步驟(Transwell)

遷移實(shí)驗(yàn)(cellmigrationassay)實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟：材料準(zhǔn)備：可拍照顯微鏡，小室，孔徑可拍照顯微鏡，小室，孔徑8pm，沒包被膠的 和 公司的也較常用， 遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的 小室相配套， 公司的 ，無血清完全培養(yǎng)基， 完全培養(yǎng)基（也可加到醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（ （步驟和流程相配套， 公司的 ，無血清完全培養(yǎng)基， 完全培養(yǎng)基（也可加到醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（ （步驟和流程基質(zhì)膠鋪板：用公司的 ：（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生胎牛血清和 培養(yǎng)基，血清），無菌，棉簽，胰酶，多聚甲）結(jié)晶紫）的量來決定）稀釋，包被小室聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。底部膜的上室面，置°C 使制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓－ ，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用 洗－遍），用含 的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至 。接種細(xì)胞取細(xì)胞懸液 加入 小室。孔板下室一般加入 含 的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)一 （主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。 較常見，時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。結(jié)果統(tǒng)計直接計數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞。取出 小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的 洗遍，甲醇固定分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。結(jié)晶紫染色 ，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用 洗遍。倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料Transwellchamber:24-well,8.0-umporemembranes(Corning)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10%血清培養(yǎng)基，PBS,0.02%EDTA固定液：甲醇染色液：Giemsa染液封片劑：中性樹膠其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwellchamber放在37°C溫育；待測細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2X105/ml；在下室(即24孔板底部)加入600—800口l含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100—150口l細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時；用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800口l甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800ulGiemsa染液的孔中，室溫染色15—30分鐘；輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；顯微鏡下取9個隨機(jī)視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。\I■■ i[i*—r-*-.rf注意事項(xiàng)根據(jù)待測細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-um孔徑(如AGS細(xì)胞)，如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10-um孔徑；根據(jù)待測細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為2心5X104/well遷移時間12^36小時；由于Corning公司的24-Transwel內(nèi)含12個獨(dú)立的chamber為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一舞孔普通培養(yǎng)板Corning；如果細(xì)胞遷移能力較弱下室液體可用3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時獲得的上清加50ug/mlFN(Fibronecti)具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；Chamber和膜上都無法標(biāo)記，操作時應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對照組；充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(cellinvasionassay)實(shí)驗(yàn)材料Matrigel(BD5mg/ml),-20°C保存其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟Matrigel在4C過夜融化；用4C預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度lmg/ml，冰上操作；在chamber上室底部中央垂直加入100口l稀釋后的Matrigel,37C溫育4－5小時使其干成膠狀；后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)(1-8)。\I■■ \ 『—r-*-.rf注意事項(xiàng)Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4C預(yù)冷；鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其他做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于一度冰箱的 度過夜(),變成液態(tài)；()取無血清培養(yǎng)基，加入(或每室) ，混勻，(C操作,最好在冰浴上)，加入上室各 (個室)；放入C培養(yǎng)箱中，孵育()；此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。注釋：無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按：稀釋，每孔加，在C培養(yǎng)箱中 。()消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液；()用無血清培養(yǎng)基洗洗次；每孔加入細(xì)胞懸液；()下腔室中加入 含有%條件培養(yǎng)基；()C培養(yǎng)箱中，孵育()取出 用 洗遍,戊二醛固定，C；()加入結(jié)晶紫( )染色或染色(一)，室溫 ，洗遍,用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。遷移實(shí)驗(yàn)

在孔板中浸泡小時；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液，每孔加入 細(xì)胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；°。培養(yǎng)箱中，孵育 ；取出 用洗遍， 戊二醛固定，°C； 洗遍，加入結(jié)晶紫（ ）染色，室溫，洗遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計數(shù) 照相，記錄。侵襲實(shí)驗(yàn)取 無血清培養(yǎng)基，加入（或 每室） ，混勻，（C操作，最好在冰浴上），加入上室各 （ 個室）；放入C培養(yǎng)箱中，孵育（ ）；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗 洗次；每孔加入 細(xì)胞懸液；下腔室中加入 無血清條件培養(yǎng)基； C培養(yǎng)箱中，孵育 ；取出 用洗遍，戊二醛固定，C