藥物分析課件第04章藥物定量分析與分析方法驗證

第四章

藥物的含量測定方法與驗證《藥物分析》課件基本要求掌握：藥物含量的容量、光譜和色譜分析法，滴定度與含量計算，色譜系統(tǒng)適用性試驗的內(nèi)容、要求及相關計算，樣品分析的前處理方法，藥物分析方法的驗證與內(nèi)容。熟悉:各類分析法的基本原理與條件選擇，樣品分析前處理方法的適用范圍，不同分析方法對驗證內(nèi)容的基本要求。了解：滴定液的配制與標定，分析儀器的校正和檢定?；緝?nèi)容一、定量分析法的分類與特點二、樣品分析的前處理方法三、藥品質量標準分析方法驗證練習與思考第一節(jié)定量分析方法分類與特點一、容量分析法

（一）容量分析法的特點幾個概念：容量分析法、滴定終點、滴定誤差

操作簡單、快速；比較準確（相對誤差＜0.2%）；儀器普通易得常用于測定高含量或中含量組分，原料藥含量測定首選（二）容量分析法的計算問題

2.滴定度的計算

aA（待測物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1×cT=c×a/b×Mc：滴定液濃度(mol/L)M：被測物分子量

1.滴定度（T）：

每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當于被測物質的質量(mg)用溴酸鉀法測定異煙肼[M(C6H7N3O)＝137.14]的含量時，溴酸鉀滴定液的摩爾濃度為0.02mol/L（以KBrO3為單元），化學反應式如下：3C6H7N3O＋2KBrO3→3C6H5NO2+3N2↑+KBr+3H2O3.百分含量的計算W：供試品取樣量

設至終點時，消耗滴定液體積為Vml則藥物理論質量為V·T濃度校正因數(shù)（1）直接滴定法（2）間接滴定法1）生成物滴定法藥物+A→B滴定滴定劑2）剩余滴定法（回滴法）藥物+A（定、過量）

→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白試驗···········································V0W司可巴比妥鈉=0.1022g，cBr2=0.05mol/L，cNa2S2O3＝0.1mol/L；V1=15.73ml，V0=23.21ml；MC12H17N2NaO3=260.27，F(xiàn)Na2S2O3＝1.038。司可巴比妥鈉的含量測定1.計算滴定度；2.計算百分含量。光譜分析法

紫外—可見分光光度法UV—Vis原子吸收分光光度法AAS熒光分析法

二、光譜分析法（一）紫外-可見分光光度法靈敏度高，可達10-4g/ml～10-7g/ml1.特點準確度高，RSD（%）為2%～5%儀器價格低廉，操作簡單，易普及，應用廣泛2.朗伯-比耳定律

A=ECL

吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)ε

——

研究分子結構

百分吸收系數(shù)

——

含量測定吸收光譜范圍：紫外：200～400nm

可見：400～760nm

3.儀器的校正和檢定

吸收度準確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波長處測定

，應符合P91表1中規(guī)定波長的校正：汞燈中的幾根較強的譜線或用儀器自身所帶的氘燈的特定譜線為參照進行校正雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液，規(guī)定波長處測定透光率，應符合P91表2中規(guī)定4.對溶劑的要求:含雜原子的有機溶劑通常具有很強的末端吸收它們的使用范圍均不能小于截止使用波長

石英吸收池、空氣為空白

λ(nm)溶劑+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.055.測定方法確定波長要求供試品溶液的A應在0.3～0.7

狹縫調(diào)整供試品溶液的吸光度對照品溶液的吸光度供試品溶液的濃度對照品溶液的濃度5.測定方法1）對照品比較法：條件：A.待測物與對照品在相同條件下測定B.待測物與對照品濃度相近制劑：原料藥：稀釋倍數(shù)取樣量平均片重片粉量2）吸收系數(shù)法（絕對法）吸光度百分吸收系數(shù)液層厚度，cm，如無特別注明，L=1cm可在手冊或文獻中查到鹽酸氯丙嗪（規(guī)格1ml:10mg，E1%1cm＝915)的含量測定：精密量取本品5ml，置200ml量瓶中，用鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻，在254nm波長處測定吸光度為0.469。計算其百分含量。3）計算分光光度法：

多種，具體按每種藥物規(guī)定的方法進行如：VA的三點校正法4）比色法加入顯色劑后，按照對照品比較法測定。影響顯色因素很多，故需注意平行操作?？瞻兹軇喝軇?顯色劑，同法處理三、色譜分析法

特點：高靈敏度、高效能、高速度、應用廣泛

按分離原理：吸附；分配；離子交換；排阻色譜分類按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC

根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線或離線對各組分逐一進行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。1.對儀器一般要求

固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變

其他均可適當改變色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢2.系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)2

分離度：R=2（tR2

–

tR1)/(W1+W2);應大于1.5重復性：對照液連續(xù)進樣5次，峰面積RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2Ａ應在0.95～1.05流出方向（一）HPLC法（1）內(nèi)標法加校正因子測定供試品中主成分含量對照品+內(nèi)標物→對照溶液，進樣，測定，計算校正因子

3.在含量測定中的應用供試品+內(nèi)標→供試品溶液，進樣，測定供試品和內(nèi)標物質的峰面積或峰高，計算含量

（2）外標法測定供試品主成分含量供試品→供試品溶液對照品→對照品溶液進樣，測定，計算含量

缺點：不易準確控制進樣量，宜用定量環(huán)進樣1.對GC儀器一般要求

載氣：氮氣

色譜柱：填充柱或毛細管柱填充柱：內(nèi)徑2～4mm，長1～10m，內(nèi)裝吸附劑高分子多孔小球或涂漬固定液的載體

毛細管柱：內(nèi)徑0.2～0.5mm，長10～100m，一般為空心柱，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液檢測器：氫火焰離子化檢測器色譜圖：30分鐘內(nèi)記錄完畢（二）GC法色譜適用性實驗、測定法：同HPLC第二節(jié)樣品分析的前處理方法

第一節(jié)定量分析樣品的前處理方法一、概述1.結構特征與分析方法之間的關系(2)含金屬有機藥物

(1)含鹵素有機藥物R-X（F，Cl,Br,I）鹵素與脂肪鏈相連R-X結合較不牢固，不需有機破壞含金屬有機藥物R-O-Me，有機酸或酚的金屬鹽/配位化合物；結合不牢固，可直接測定

有機金屬藥物R-Me

，結合牢固，適當處理后測定

鹵素與芳環(huán)相連Ar-X結合牢固，需/不需有機破壞泛影酸三氯叔丁醇富馬酸亞鐵硬脂酸鎂醋酸苯汞2.藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機破壞的分析方法不經(jīng)有機破壞的分析方法二、不經(jīng)有機破壞的分析方法終點：鄰二氮菲(+Fe3+)溶于熱稀礦酸Fe2+鈰量法Ce4+Fe3+指示劑:鄰二氮菲(+Fe2+)紅色淡藍色（一）直接測定法例如：富馬酸亞鐵的含量測定（二）經(jīng)水解后測定法

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH

(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O

NaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN↓+NH4NO3

△

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

1.堿水解后測定法適用于X與脂肪鏈相連的鹵代烷烴例如：三氯叔丁醇的含量測定

2.酸水解后測定法

例如：硬脂酸鎂的含量測定

（三）經(jīng)還原分解后測定法

指示劑：曙紅鈉終點：黃→紅適用于Ar-I的藥物例如：泛影酸的含量測定三、經(jīng)有機破壞的分析方法－－－－凱氏定氮法金屬原子、鹵素等與C結合牢固者，必須有機破壞藥物分析中常用的有機破壞的方法有干法破壞濕法破壞

(一)濕法破壞H2SO4-HNO3法H2SO4-HClO4法H2SO4-硫酸鹽法H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等（二）干法破壞2.氧瓶燃燒法適用于含鹵素、S、P等有機藥物分析的前處理，也用于某些藥物中Se及砷鹽的檢查1.高溫熾灼法加無水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化1）儀器裝置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬質玻璃錐形瓶2）稱樣固體樣；液體樣；軟膏類樣品要求3）燃燒分解操作法4）吸收液的選擇用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測定時多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2.應用示例：碘苯酯的測定返回第三節(jié)藥品質量標準分析方法驗證均需對分析方法進行驗證驗證內(nèi)容：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性目的：證明采用的方法適合于相應檢測要求。起草藥品質量標準生產(chǎn)工藝變更制劑組分改變原分析方法修訂一、準確度是指用該方法測定結果與真實值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準確度1.原料藥：可用已知純度對照品或供試品進行測定；或與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較2.制劑：考察其他組分和輔料對回收率的影響①用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進行測定，回收率計算同原料藥②向制劑中加入已知量的被測物進行測定③與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較（二）具體做法：測定高、中、低三個濃度，n=3,共9個數(shù)據(jù)來評價回收率；用UV和HPLC法時，一般回收率可達98.0%～102.0%；容量法可達99.7%～100.3%回收率試驗精密稱取鹽酸小檗堿約40mg，按處方比例加入其它組分和輔料，用適量沸騰的0.05mol/LH2SO4

溶解。放冷置室溫，定量轉移至250ml量瓶中，并稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液5.00ml于100ml量瓶中并稀釋至刻度，按所選定的方法計算回收率。測定結果見下表。三波長分光光度法測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量回收率試驗取連蒲雙清片粉適量（約相當于鹽酸小檗堿40mg)，精密稱取，精密加入鹽酸小檗堿約40mg

，用0.05mol/LH2SO4

溶解。放冷置室溫，定量轉移至250ml量瓶中，并稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液5.00ml于100ml量瓶中定容，按所選定的方法計算回收率。測定結果見下表。三波長分光光度法測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量2.

相對標準偏差(RSD)

1.

標準偏差（SD或S）二、精密度（一）精密度表示方法（二）驗證內(nèi)容

1.

重復性

在相同條件下,由一個分析人員測定所得結果的精密度.

2.

中間精密度

在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果的精密度。

3.

重現(xiàn)性

在不同實驗室由不同分析人員測定結果的精密度。（三）數(shù)據(jù)要求均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限三、專屬性指在其他成分(如雜質、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性鑒別、雜質檢查、含量測定方法，均應考察其專屬性（一）鑒別反應應能與其它共存的物質或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應呈現(xiàn)負反應。（二）含量測定和雜質測定

色譜法和其他分離法，應附代表性的圖譜，以說明專屬性。圖中應注明各組分的位置，色譜法中分離度應符合要求。在能獲得雜質的情況下，可加到試樣中，考察對結果的干擾。在雜質和降解物不能獲得的情況下，可用已驗證方法或藥典方法進行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。

四、檢測限（LOD)

是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標。它無需準確定量，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.目視法用含已知濃度被測物的試樣進行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC2.當用GC和HPLC法時，一般以S/N＝2或3時的相應濃度來確定檢測限。

五、定量限（LOQ)

是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。

雜質和降解產(chǎn)物進行定量測定時，要求LOQ。常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時相應的濃度進行測定。六、線性

是指在設計的范圍內(nèi)，測試結果與試樣中被測物濃度或量直接呈正比關系的程度。

回歸方程的相關系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進行測定，以響應值對濃度作圖，建立回歸方程，求出r。如UV：制備一個標準系列，濃度點n=5A=0.3-0.7建立回歸方程C=aA+b，

r＞0.9999七、范圍

如原料藥和制劑含量測定：應為測試濃度的80%～120%制劑含量均勻度檢查：應為測試濃度的70%～130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：應為限度的±20%。是指達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

八、耐用性

是指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。HPLC變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動因素有：色譜柱，固定相，擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。

分析方法效能指標的具體應用：1.用于鑒別試驗：只要求專屬性、耐用性2.用于原料藥中雜質測定和制劑中降解產(chǎn)物測定的方法：①用于定量：除檢測限不要求外，其余指標均要求。②限度檢查：只要求檢測限、專屬性、耐用性3.原料、制劑的含量測定及溶出度測定：不要求檢測限和定量限，其余均要求。練習與思考[A型題]1．相對標準偏差表示的應是A．準確度B．回收率C．精密度D．純凈度E．限度2．表示兩變量指標A與C之間線性相關程度常用A．相關規(guī)律B．比例常數(shù)C．相關常數(shù)D．相關系數(shù)E．精密度

1～4A．空白試驗B．對照試驗C．回收試驗D．鑒別試驗E．檢測試驗1．以同量的溶劑替代供試品同法進行測定試驗2．在供試液中加入已知量的標準物或已知量的被測物后，同法進行測定試驗3．用已知量的純物質作為試樣，同法進行測定試驗4．取少許水楊酸，加水溶解，加三氯化鐵試液，顯紫堇色ACDB[B型題][X型題]1．藥物分析方法的效能指標有

A．檢測限B．耐用性C．準確度D．專屬性E．代表性2．對藥物中雜質進行檢查時，要求所用的檢查方法應具有

A．耐用性B．專屬性C．檢測限D．準確度E．線性與范圍3．用信噪比表示檢測限時，信噪比一般應為

A．1∶1B．2∶1C．3∶1

D．4∶1E．5∶1

返回１.在設計的范圍內(nèi)，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度稱為（）A.精密度B.耐用性C.準確度D.線性E.范圍2.用HPLC測得兩組分的保留時間分別為8.0min和10.0min，峰寬分別為2.8mm和3.2mm，記錄紙速為5.0mm/min，則兩峰的分離度為（）

A.3.4

B.3.3

C.4.0

D.1.7

E.6.83.用直接滴定法測定阿司匹林原料藥的含量，若供試品的稱樣質量為m(g)，氫氧化鈉滴定液的濃度為c(mol/l)，消耗氫氧化鈉滴定液的體積為V(ml)，1ml氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l)相當于18.02mg的阿司匹林，則含量的計算公式為（）４.準確度是指用某分析方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般以（）A.百分回收率表示B.偏差表示C.標準偏差表示D.相對標準偏差表示E.重現(xiàn)性表示５.回收率屬于藥物分析方法驗證指標中的（）

A.精密度B.準確度C.檢測限D.定量限

E.線性與范圍６.中國藥典規(guī)定紫外分光光度法測定中，溶液的吸收度應控制在（）

A.0.00～2.00

B.0.3～1.0

C.0.2～0.8

D.0.1～1.0

E.0.3～0.77.GC、HPLC法中的分離度（Ｒ）的計算公式為(

)

１.選擇氧瓶燃燒法所必備的實驗物品包括（）

A.磨口硬質玻璃錐形瓶B.鉑絲C.氫氣

D.無灰濾紙E.凱氏燒瓶多項選擇題２.有機鹵素藥物常用的測定方法有（）

A.直接回流后測定法B.堿性還原后測定法C.氧瓶燃燒分解后測定法D.直接絡合滴定法E.硝酸銀標準液直接滴定法３.含鹵素及含金屬有機藥物，測定前預處理的方法可以采用（）

A.堿性還原法B.堿性氧化法C.氧瓶燃燒法

D.堿熔融法E.直接回流法多項選擇題４.氧瓶燃燒法可用于（）

A.含鹵素化合物的含量測定B.醚類藥物的含量測定C.檢查甾體激素類藥物中的氟D.檢查甾體激素藥物中的硒E.芳酸類藥物的含量測定５.干法破壞應注意的是（）

A.加熱溫度應在420℃以下，以防止被測金屬化合物的揮發(fā)

B.應灰化完全

C.樣品應先大火加熱炭化后，小火加熱使樣品灰化

D.破壞后不溶的灰分，不應棄去

E.可加入高錳酸鉀、H2O2多項選擇題一、最佳選擇題1．含溴有機化合物經(jīng)氧瓶燃燒后生（）。A.紫色煙霧B.棕色煙霧C.黃色煙霧D.白色煙霧E.紅色煙霧2．測定鹵素原子與脂肪碳鏈相連的含鹵素有機藥物（如三氯叔丁醇）的含量時，通常選用的方法是（）。A.直接回流后測定法B.直接溶解后測定法C.堿性還原后測定法D.堿性氧化后測定法E.原子吸收分光光度法3．氧瓶燃燒法測定含氯有機藥物時所用的吸收液多數(shù)為（）。A.H2O2溶液B.H2O2-NaOH溶液C.NaOH溶液D.硫酸肼飽和溶液E.NaOH-硫酸肼飽和溶液4．三氯叔丁醇的含量測定是含鹵素藥物測定鹵素的代表性方法，這種方法是（）。A.酸水解法B.堿水解法C.堿氧化法D.堿熔法E.堿還原法5．含金屬有機藥物亞鐵鹽的含量測定一般采用（）。A.氧化后測定B.直接容量法測定C.比色法測定D.灼燒后測定E.重量法測定6．氧瓶燃燒法測定，要求備有適用的（）。A.無灰濾紙，用以載樣B.鉑絲（鉤或籃），固定樣品或催化氧化C.硬質磨口具塞錐形瓶（用以貯氧、燃燒、吸收）及純氧D.A＋B

E.A＋B＋C7．有機鹵素藥物中的鹵原子為芳環(huán)的取代基時，為使其轉變?yōu)闊o機鹵素離子，應該采用的方法是（）。A.將藥物溶于溶劑，加堿后，回流使其溶解B.將藥物溶于堿溶液，加強還原劑，加熱回流，使其裂解C.將藥物溶于堿溶液，加強氧化劑，加熱回流，使其裂解D.氧瓶燃燒法E.凱氏定氮法8．三氯叔丁醇的含量測定，采用氧瓶燃燒后剩余銀量法，以稀硫酸鐵銨為指示劑，用硫氰酸銨滴定剩余的硝酸銀，在滴定之前加鄰苯二甲酸二丁酯的作用是（）。A.防止AgCl轉化為AgSCN

B.促使AgCl轉化為AgSCNC.防止Fe3＋水解D.防止其他陰離子（如）的干擾E.使終點易于辨認10．三氯叔丁醇采用銀量法測定含量，其樣品前處理方法為（）。A.堿性條件下回流B.堿性條件下還原C.酸性條件下還原D.酸性條件下水解E.以上都不是11．測定碘與苯相連的含鹵素有機藥物（如碘苯酯）的含量時，通常選用方法是（）。A.直接回流后測定法B.直接溶解后測定法C.氧瓶燃燒后測定法D.堿性氧化后測定法E.原子吸收分光光度法12．測定氧與金屬鍵相連的含金屬有機藥物（如富馬酸亞鐵）的含量時，通常選用方法是（）。A.直接測定法B.汞齊化測定法C.堿性、酸性還原后測定法D.堿性氧化后測定法E.原子吸收分光光度法13．在設計的范圍內(nèi)，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度稱為（）。A.精密度B.耐用性C.準確度D.線性E.范圍14.用直接滴定法測定阿司匹林原料藥的含量，若供試品的稱樣質量為m(g)，氫氧化鈉滴定液的濃度為c(mol/l)，消耗氫氧化鈉滴定液的體積為V(ml)，1ml氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l)相當于18.02mg的阿司匹林，則含量的計算公式為（）16．準確度是指用某分析方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般以（）。A.百分回收率表示B.偏差表示C.標準偏差表示D.相對標準偏差表示E.重現(xiàn)性表示17．回收率屬于藥物分析方法驗證指標中的（）。A.精密度B.準確度C.檢測限D.定量限E.線性與范圍18．原料藥物分析方法的選擇性應考慮下列哪些物質的