RT-qPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

RealTimeQuantitativePCR南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院lfnnLogo

RT-qPCR原理Contents1

RT-qPCR步驟2

SYBR實(shí)驗(yàn)步驟3LogoRT-qPCR原理1定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。1.熒光原理：SYBRGreen2.定量原理：（1）介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值（2）定量原理：

絕對(duì)定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線）、相對(duì)定量（2-ΔΔCt）

（3）融解曲線非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

結(jié)合于雙鏈DNA小溝之間，只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。（在變性過(guò)程中無(wú)熒光，在復(fù)性及延伸過(guò)程中發(fā)出熒光）RT-qPCR原理---熒光原理特異性熒光標(biāo)記：

1、TaqMan

水解型雜交探針。5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)R，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)Q。探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針R與Q分開，發(fā)出熒光。

2、MolecularBeacon

分子信標(biāo)。標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)，莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成。變性過(guò)程：產(chǎn)生非特異性熒光；延伸過(guò)程：不產(chǎn)生熒光；退火過(guò)程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測(cè)熒光信號(hào)。

3、Amplisensor

雙鏈信號(hào)引物，進(jìn)行半巢式擴(kuò)增；隨著PCR循環(huán)的重復(fù)進(jìn)行，信號(hào)引物的雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，其中一條鏈參與到產(chǎn)物的合成中，熒光消失，產(chǎn)物量與熒光成反比。QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值極具重現(xiàn)性。分析定量時(shí)多取15-35較好。熒光信號(hào)閾值（threshold）：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值。熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：

擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：

第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴(kuò)增效率

logX0=-log(1+Ex)*Ct+log

X

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量.1.絕對(duì)定量LogoRT-qPCR原理----絕對(duì)定量1模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量1.絕對(duì)定量LogoRT-qPCR原理----絕對(duì)定量1R2為相關(guān)系數(shù)：R2>0.99時(shí)，認(rèn)為兩數(shù)值之間相關(guān)性好。E為擴(kuò)增效率：一般認(rèn)為在90%-110%之間數(shù)據(jù)可用。LogoRT-qPCR原理----相對(duì)定量12.相對(duì)定量病人內(nèi)參基因病人目的基因?qū)φ諆?nèi)參基因?qū)φ漳康幕駽tabcd結(jié)果表示病人的目的基因的表達(dá)是對(duì)照組目的基因表達(dá)的多少倍。RT-qPCR原理----融解曲線溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)融解曲線為單一峰，無(wú)非特異性熒光，定量準(zhǔn)確。溶解峰反映反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物的量。前面雜峰較多時(shí)可能原因?yàn)闃悠肺椿靹?。RT-qPCR步驟----SYBRGreen法1.準(zhǔn)備物品：檢測(cè)樣本、內(nèi)參、引物、熒光染料、八連管、移液槍、Realplex軟件2.將樣本等稍許離心3.加樣（可將所有共同物質(zhì)加入同一管中，混勻后分散入其他管中）

反應(yīng)體系：ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL樣本1μL4.將八連管標(biāo)記后離心至無(wú)壁掛液體5.將其置入Realplex儀中，

設(shè)置程序：95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循環(huán)，END后右鍵設(shè)置“insert---meltingcurve”，后綠色運(yùn)行6、反應(yīng)結(jié)束后將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，分析數(shù)據(jù)。反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2（多聚酶的激活劑）濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同RT-qPCR步驟----SYBRGreen法對(duì)DNA模板沒