實驗一 顯微攝影技術

實驗一光學顯微鏡使用及顯微攝影技術一、實驗目的1、了解光學顯微鏡結(jié)構(gòu)原理并熟練掌握其操作方法；2、掌握顯微攝影技術操作流程，了解傳統(tǒng)攝影技術中照片洗印操作流程；3、了解暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、微分干涉差顯微鏡、倒置顯微鏡、等的構(gòu)造和使用方法。二、實驗原理

顯微鏡的放大效能是由其照明系統(tǒng)所使用光的波長和透鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，縮短使用的光波長或增加數(shù)值孔徑可以提高分辨率?？梢姽獾墓獠ㄕ穹^窄，因此使用較短波長的紫外光作為光源系統(tǒng)，可以提高分辨率。而對于一臺普通光學顯微鏡，一般來說，提高其分辨率主要通過提高數(shù)值孔徑（選用鏡口角大的透鏡，提高介質(zhì)折射率）。基礎知識顯微鏡概述：

顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。1.光學顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)等。

尼康E-600顯微鏡

光學顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：1.

照明燈(Lamp)2.

聚光器(Condenser)3.

載物臺和切片夾(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.

推進器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.

物鏡(Objectives)6.

粗細螺旋(Courseandfinefocusknob)7.

目鏡(Oculars)8.

照相機等接口(Connectiontocamera,etc.)2.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）

熒光顯微鏡(Fluorescencemicroscope)：

以紫外線為光源,用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學物質(zhì)的分布及定位等。細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。3.激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍色為細胞核，綠色為微管

用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。

4.暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有當光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。5.相差顯微鏡

一種介殼蟲的染色體

相差顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。活細胞和未染色的生物標本，因細胞各部細微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。6.偏光顯微鏡

將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。偏光顯微是鑒定物質(zhì)細微結(jié)構(gòu)光學性質(zhì)的一種顯微鏡。凡具有雙折射性的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當然這些物質(zhì)也可用染色法來進行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。雙折射性是晶體的基本特征。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物、化學等領域。在生物學中，很多結(jié)構(gòu)也具有雙折射性，這就需要利用偏光顯微鏡加以區(qū)分。在植物學方面，如鑒別纖維、染色體、紡錘絲、淀粉粒、細胞壁以及細胞質(zhì)與組織中是否含有晶體等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起組織內(nèi)化學性質(zhì)的改變，可以偏光顯微術進行鑒別。在人體及動物學方面，常利用偏光顯微術來鑒別骨骷、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細胞、橫紋肌和毛發(fā)等。

7.微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）8.倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。9.透射電子顯微鏡

JEM-1011透射電子顯微鏡

萊卡超薄切片機

用透過樣品的電子束使其成像的電子顯微鏡。在光學顯微鏡下無法看清亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多。目前TEM的分辨力可達0.2nm。由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機（ultramicrotome）制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍

要知道的幾個重要的分辨率

人眼：0.2mm光學顯微鏡：0.2um電子顯微鏡：0.2nm內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）

冰凍蝕刻電鏡照片

10.掃描電子顯微鏡

JEOL掃描電子顯微鏡人類血細胞SEM照片

厚標本和薄標本4-5um2um基礎知識顯微攝影裝置的安裝與調(diào)試↓顯微鏡的光路調(diào)整↓裝入膠片↓取景聚焦↓暴光:1/15sec(應先測光:綠燈亮可以正確暴光)↓黑白膠片的沖洗:顯影3min→停顯10sec→定影15min→水洗:流水沖洗30min→晾干↓印相放大:取景聚焦→暴光→顯影→停顯10sec→定影15min→水洗:流水沖洗30min↓上光剪切三、傳統(tǒng)膠片顯微攝影過程顯微攝影技術利用顯微攝影裝置拍攝顯微鏡(或解剖鏡)視野中物象的技術稱為顯微攝影。顯微攝影技術主要包括兩個方面：拍攝：

需要一套完備的顯微攝影裝置洗印放大：需要一個較好的暗室和成套的洗印放大設備。三、實驗用品雙目顯微鏡，生物標本，擦鏡紙等四、實驗內(nèi)容1、雙目顯微鏡的操作規(guī)范：取送→放置→對光→低倍物鏡使用→高倍物鏡使用→油鏡使用→保養(yǎng)維護顯微鏡使用及繪圖（1）取、放顯微鏡的正確做法

一手握鏡臂，一手托鏡座，托在胸前。小心輕放，避免震動。放在距離桌邊5-10cm左右為好。（2）對光

先將低倍物鏡對準通光孔，調(diào)整反光鏡（外光源顯微鏡）或電源電壓（內(nèi)光源顯微鏡），使視野中的光線明亮而不刺眼。也可以改變孔徑光圈或改變聚光器的位置達到改變照明的目的，但反光鏡一定要調(diào)到最佳的角度。（3）放置標本

將標本放在載物臺上，固定好。將玻片中有標本的地方移到通光孔的中央。如果位置不是在中央，因為物鏡的觀察范圍有限，有可能觀察不到所要看到的內(nèi)容。

顯微鏡的正確使用方法（4）調(diào)整焦距

眼睛不要看目鏡，要從側(cè)面注視低倍鏡與標本。慢慢轉(zhuǎn)動粗準焦距螺旋，使物鏡與玻片標本接近。待目測低倍鏡與標本蓋玻片之間的距離比低倍物鏡的工作距離（7.63mm）小一些時，即可注視目鏡，并向相反的方向調(diào)節(jié)粗準焦螺旋，使物鏡與標本的距離增大，慢慢會看到視野中物像的出現(xiàn)。注意這一操作如果違章有可能會損壞儀器或標本?。?）使用低倍鏡觀察移動標本，找到要觀察的位置。用細準焦螺旋調(diào)清物像。（6）使用高倍鏡觀察

將需觀察的位置移到顯微鏡視野的中央，將高倍鏡換入即可。使用高倍鏡前一定要用低倍鏡進行觀察。不可直接用高倍鏡。顯微鏡的正確使用方法（7）使用油鏡觀察在觀察細小結(jié)構(gòu)時需要使用100倍的物鏡。100倍的物鏡需要在油的介質(zhì)中工作，故稱油鏡或油浸物鏡。油鏡需在物鏡與標本之間充上一種折光率與玻璃一樣高的介質(zhì)，通常使用香柏油，才能使物像清晰。方法是先低倍，后高倍，再用油鏡。（8）顯微鏡用后應先轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，將高倍物鏡或油鏡旋出通光孔的上方，再取下玻片標本。一定要及時清除油鏡上的油。將反光鏡放在豎直的位置，以減少落上灰塵。保持清潔，罩好防塵罩。

生物繪圖方法（1）看清楚把正常的、一般的結(jié)構(gòu)與偶然的、人為的一些結(jié)構(gòu)區(qū)分開，然后選擇那些有代表性的典型的部位進行繪圖。（2）定位置先確定要畫的圖在實驗報告紙上的位置和大小，力求布局合理、美觀，不能任意的無計劃的畫圖，否則位置不適當或偏在一角、或過大過小，影響注字和說明?？紤]在左側(cè)一邊留一定邊緣，以備裝訂之用。（3）定大小一般盡可能的把圖畫大些。如果是細胞圖，為了清楚表明細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所畫細胞不宜過多，1～2個即可，但每個細胞的各個部分按同比例適當放大，如畫輪廓圖或圖解圖，也不一定把全部切面（如根莖的橫切面圖）畫出，根據(jù)需要畫出1/2～1/8即可。（4）求真實須注意其科學性，精確性，不能任意臆造，加以美化，繪圖力求準確。先用HB鉛筆起草，后用硬鉛筆畫出。（5）用點線圖只用點和線表示。生物繪圖法中除了輪廓線以外，其余表現(xiàn)物體立體感、大小、厚度、形態(tài)的唯一形式是打點，即使用HB鉛筆打點來表現(xiàn)光線明暗。切不可涂黑，細胞壁用平行的雙線表示，線條要細而圓滑，粗細均勻，原生質(zhì)體內(nèi)的結(jié)構(gòu)（如細胞質(zhì)、細胞核等）要用疏密的點表示，點要細圓，不拖尾巴。細胞與其他細胞相連接處要畫出一些來，以表示所畫的細胞不是孤立的。（6）勤對照與顯微鏡下實物對照，檢查一下是否有無遺漏或錯誤.（7）做注釋用直線從各部分引出并注出名稱。字最好在圖右側(cè)，字要端正、大小一致、排列整齊。每個圖的下方注明圖的名稱及所用材料，例如“洋蔥表皮細胞”、“小麥穎果縱切”等。生物繪圖方法生物繪圖要求（1）形態(tài)結(jié)構(gòu)要準確，比例要正確，要求真實感，立體感，精美而美觀。圖中較暗部分用點表示,用點的稀疏稠密表示黑暗程度，不能使用橫線或者涂黑。