酶與細胞的固定化技術(shù)

第五章酶與細胞的固定化技術(shù)酶的固定化細胞及細胞器的固定化固定化酶（細胞）的評價指標第一節(jié)酶的固定化水不溶性載體水溶性酶水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)固定化酶是指借助于物理或化學(xué)方法，將酶固定在載體上，并在一定的空間內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體。固定化酶的特點穩(wěn)定性提高，使用壽命延長可得到高純度、高產(chǎn)量的產(chǎn)品可以連續(xù)化生產(chǎn)操作反應(yīng)的最優(yōu)化控制成為可能再生產(chǎn)利用缺點酶活力有一定損失，初始的投資大。只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜。與完整細胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定。一、酶的固定化方法1．物理吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。載體類別：天然無機載體：活性炭，硅藻土，硅膠等。有機載體：淀粉，纖維素，谷膠原等。

2、包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。分為：（1）網(wǎng)格型（2）微囊型（1）網(wǎng)格型

將酶或含酶菌體包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。載體材料：合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，光敏樹脂天然高分子多糖類：淀粉，明膠，海藻酸，角叉菜膠。

聚丙烯酰胺包埋制備固定化酶的過程：將酶溶液加入到含有丙烯酰胺（單體）和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑）的溶液中，再加入二甲氨基丙腈（加速劑），同時加入過硫酸鉀（引發(fā)劑）混合，于25℃保溫10min，即得含酶凝膠，將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒，于低溫儲存或冷凍干燥。（2）微囊型將酶或微生物菌體包埋在高分子半透膜中的微囊內(nèi)稱為微囊型包埋法。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。①界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成膜從而將酶包埋。②界面聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合形成半透膜，將酶包埋于半透膜微囊中。

③二級乳化法酶溶液先在高聚物（乙基纖維素、聚苯乙烯等）有機相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次級乳化液，當有機高聚物固定化后，每個固體球內(nèi)包含多滴酶液。④脂質(zhì)體包埋法采用雙層脂質(zhì)體形成的極細球粒包埋酶。3、結(jié)合法通過選擇適宜的載體，通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法

通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度優(yōu)缺點：操作簡便，條件溫和，酶活力回收率高；易受緩沖液種類和pH影響，易脫離。共價鍵結(jié)合法通過共價鍵將酶蛋白的側(cè)鏈基團與載體的官能團結(jié)合的固定化方法。可以形成共價鍵的基團：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵(非活性中心基團)常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體優(yōu)缺點：操作復(fù)雜，酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，回收率低，不適用于微生物細胞固定；不易脫落。首先載體上引進活潑基團關(guān)鍵然后活化該活潑基團最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”重氮法疊氮法烷基化反應(yīng)法硅烷化法溴化氰法載體活化的方法①重氮法

是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8∽9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。反應(yīng)示意式如下目前在我們國內(nèi)用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等該方法需要載體具有芳香族氨基②疊氮法對含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶聯(lián)。③溴化氰法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。④烷基化反應(yīng)法

含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體。4、交聯(lián)法

借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶交聯(lián)法常用試劑常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N，N’乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)。雙重固定法吸附交聯(lián)法交聯(lián)包埋法將酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，熱處理也可與交聯(lián)法或其他固定化法聯(lián)合使用，進行雙重固定化。5、熱處理法各種固定方法的特點比較復(fù)合載體PEI-SIO2的制備首先對硅膠進行活化處理：取5g硅膠至于30ml甲烷磺酸水溶液控制溫度在102℃，攪拌活化4h，洗滌，抽濾后真空干燥24h即可；然后使硅膠發(fā)生氯丙基化，將活化后的硅膠以二甲苯為溶劑，加入少量的水，與γ-氯丙基三甲氧基硅烷在80℃反應(yīng)6h，抽濾后的產(chǎn)物在索氏抽屜器中用甲苯抽屜24h，以除去γ-氯丙基三甲氧基硅烷，分離后產(chǎn)物經(jīng)真空干燥，所制產(chǎn)物為氯丙基化的硅膠（CP-SIO2）；最后，準確稱量1g氯丙基化的硅膠，至于一定濃度的聚乙烯亞胺水溶液中，于一定的溫度下反應(yīng)一段時間，用大量蒸餾水沖洗產(chǎn)物，抽濾，真空干燥后制得PEI-SIO2復(fù)合載體。稱取0.5g經(jīng)干燥的復(fù)合載體PEI-SIO2，加入適量的戊二醛溶液，攪拌并在室溫條件下反應(yīng)1h，產(chǎn)物用蒸餾水沖洗后抽濾，再加入30ml經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液稀釋過的脂肪酶液，在恒溫水浴振蕩器中于給出的溫度下震蕩一定的時間，即可制的固定化的脂肪酶。Table1IndependentvariablesandtheirlevelsforcentralcompositedesignIndependentvariablescodesVariablelevels-10+1MethanolmolarratioX1246Enzymeamount(%)X2369HexaneweightratioX30.30.60.9Temperature(℃)X4304050IndependentvariablescodesVariablelevels-2-10+1+2Enzymeamount(%)X112345Addedwater(v/v)X2246810MethanolmolarratioX323456Reactiontemperature(℃)X42535455565Reactiontime(h)X548121620RunX1X2X3X4Truemodel(%)RSMmodel(%)Error(%)1-1-10047.446.661.562-110055.7453.843.4131-10045.6847.303.554110060.8661.320.75500-1-171.9371.350.81600-1167.9367.980.077001-170.8670.470.068001172.1772.410.339-100-153.7455.583.4210-100154.3754.340.0611100-157.5859.112.6612100159.2758.910.61130-1-1066.0965.950.21140-11054.155.151.941501-1063.4563.980.7416011076.6178.322.2317-10-1046.3445.12.6818-101053.3750.714.981910-1056.4552.996.1320101055.850.938.73210-10-171.4468.683.86220-10170.1566.535.1623010-180.477.843.1824010182.0378.574.2225000089.3589.210.1526000089.6589.210.4927000091.0289.211.99Y=-174.942+53.543X1+9.479X2+127.56X3+4.143X4+0.285X1X2-3.198X1X3+0.013X1X4+6.986X2X3+0.024X2X4+0.442X3X4-6.605X12-1.167X22-142.839X32-0.058X42Fattyacidmethylestercontetnt(%)Rentiontime(min)Content(%)7-Hexadecanoicacidmehtylester(C17H32O2)6.590.72Hexadecanoicacidmehtylester(C17H34O2)6.7314.829,12-Octadecadienoicacidmethylester(C19H34O2)8.1835.799-Octadecadienoicacidmethylester(C19H36O2)8.2440.96Octadecadienoicacidmethylester(C19H38O2)8.457.511-Eicosenoicacidmethylester(C21H40O2)10.260.07Eicosenoicacidmethylester(C21H42O2)10.530.14二、固定化酶的性質(zhì)

1、固定化對酶穩(wěn)定性的影響大多數(shù)情況下，具有較長的操作壽命和保存壽命。原因：酶固定化使其活性構(gòu)象的牢固性增加，酶分子與載體的多方位連接降低了酶分子的伸展變性。酶固定化能降低自身降解的程度載體的保護使得酶抗不良環(huán)境因素的影響的能力增強。固定化酶穩(wěn)定性升高表現(xiàn)在：熱穩(wěn)定性增強對變性劑、抑制劑的耐受性提高對蛋白酶抵抗能力增加、儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性有所增強。2、最適溫度固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，但有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會有明顯的變化。1）載體帶負電荷，pH向堿性方向移動。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。最適pH值

載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。（2）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低。4、底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。5、米氏常數(shù)固定化酶的表觀米氏常數(shù)隨載體的帶電性能而變化。（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km'<Km三、固定化酶的應(yīng)用1、工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用（1）氨基?；福?）葡萄糖異構(gòu)酶（3）延胡索酸酶2、酶電極 （1）葡萄糖電極 半透膜 酶膠層

感應(yīng)電極

酶電極示意圖葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極第二節(jié)細胞及細胞器的固定化細胞固定化：通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細胞的過程。固定化活細胞或固定化增值細胞：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。一、微生物細胞固定化固定微生物細胞時，操作簡便易行，對細胞的生長、繁殖和新陳代謝沒有明顯的影響，但吸附力較弱，吸附不牢固，細胞容易脫落。吸附法是制備固定化動物細胞的主要方法，主要是因為動物細胞大多數(shù)具有附著特性。吸附法是制備固定化植物細胞：硅藻土、多空玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料、纖維素等。（2）包埋法將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細胞的方法（凝膠包埋法、半透膜包埋法）。瓊脂糖凝膠包埋法海藻酸鈣凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法2、固定化微生物細胞的特點固定化微生物細胞保持了細胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。固定化微生物細胞保持了原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來的代謝途徑進行新陳代謝。發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或連續(xù)使用提高了細胞密度，提高產(chǎn)率。3、固定化微生物細胞的應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物。利用固定化微生物細胞與各種電極結(jié)合制成微生物電極。呼吸活性測定型傳感器：利用固定在高分子膜上的微生物細胞的呼吸作用，測定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測定物質(zhì)的量。電極活性測定型傳感器：利用固定在膜上的微生物細胞的新陳代謝作用，測定電極活性物質(zhì)的量的變化，從而確定樣品中欲測物質(zhì)的含量。二、植物細胞固定化（1）植物細胞固定化方法吸附法：一般將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上。包埋法：將植物細胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠中。（2）固定化細胞的特點固定化植物細胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，有利于生產(chǎn)各種所需的次級代謝物。提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定,可連續(xù)使用較長的時間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率.不容易聚集成團,有利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。（3）固定化植物細胞的應(yīng)用①制造人工種子細胞全能理論：在一定的條件下，細胞會生長、繁殖長成一顆完整的植株。通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)，可以由一粒種子快速繁殖得到大量細胞，再通過固定化技術(shù)進行人工種子的研制，獲得大量具有相同遺傳特性的植株。

②固定化植物細胞可以用于生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶等次級代謝物。（胞外產(chǎn)物）三、動物細胞固定化1、動物細胞固定化的方法①吸附法常用的吸附固定化載體轉(zhuǎn)瓶：由玻璃或塑料制成，其表面經(jīng)過一定的方法處理可帶上電荷。微載體：顆粒細小的固定化載體，由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。中空纖維：由聚丙烯