DNA的提取,核酸的瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)一、

DNA的提取，核酸的瓊脂糖凝膠電泳主要內(nèi)容

1、基因組DNA的提取；2、核酸的瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)達(dá)到的基本要求或能力標(biāo)準(zhǔn)

掌握DNA提取原理與方法；核酸的瓊脂糖凝膠電泳原理與方法1.DNA提取

天然狀態(tài)的DNA

是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。在濃氯化鈉（1-2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。1.1DNA提取原理1.1DNA提取原理

CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中結(jié)合核酸、沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。

陰離子去污劑（如SDS,十二烷基磺酸鈉）處理核蛋白，DNA（或RNA）即與蛋白質(zhì)分開，酚-氯仿-異戊醇處理，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量有機(jī)物（乙醇或異丙醇），DNA即析出。

酚-氯仿作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制DNase的降解作用，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。混合后離心，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。三羥甲基氨基甲烷（Tris）(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;

EDTA螯合Mg2+、Mn2+離子,抑制DNase活性;

NaCl

提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中;

異戊醇能消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等?反復(fù)凍融法?超聲波處理法?冷熱交替法?有機(jī)溶劑處理法?去污劑?溶脹法細(xì)胞破碎方法：?DNA的純化采用不同方式，主要有沉淀法和固體介質(zhì)吸附法。沉淀法是用試劑乙醇和異丙醇等沉淀濃縮DNA，在DNA沉淀過程中可使用DNA共沉淀劑如糖原、PEG或tRNA以提高DNA的得率。固體介質(zhì)吸附法是指采用陰離子交換樹脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。提取DNA時(shí)，可同時(shí)采取幾種純化方法。1.2.DNA提取操作康為世紀(jì)柱式基因組提取試劑盒（CW22978）2.核酸瓊脂糖凝膠電泳2.1.核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理在pH值為8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片斷。瓊脂糖的孔徑大，可以分離長度為100bp至60kb的核酸片斷；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。

溴化乙錠(EB)可插入到DNA分子的雙鏈中，在紫外光的照射下，插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示DNA含量和位置。2.2.核酸瓊脂糖凝膠電泳的操作(一）、制膠

1．稱取0.4g（適量）瓊脂糖置于三角瓶中，加入50ml0.5×TBE(或1×TAE)緩沖液。

2．微波爐加熱，煮沸、振搖，反復(fù)加熱、振搖2-3次，使瓊脂糖充分融化。

3．膠帶將膠床兩端粘好，底部粘嚴(yán)，以防凝膠滲漏，插好梳子。

4．待膠冷卻至60℃左右時(shí)，將融化的瓊脂糖小心地倒入膠床中，速度要快，除去氣泡，

讓膠自然冷卻至完全凝固（約需要20-30分鐘）。

5．小心向上方拔出梳子，避免前后左右搖晃，以防破壞膠面及加樣孔，去掉制膠槽兩邊的膠帶，小心將膠和膠床放入電泳槽中，樣品孔在陰極端。

6．向電泳槽中加入0.5×TBE(或1×TAE)電泳緩沖液，液面高于膠面約1-2mm。（二）、上樣電泳

1、取2μl上樣液（溴酚藍(lán)指示劑）于Parafilm上，加2μl水與2μl樣品DNA反復(fù)吹吸，混勻。

2、Tip頭垂直伸入液面下膠孔中，小心上樣于孔中。

3、接通電源，打開開關(guān)，電泳開始以正、負(fù)極鉑金絲有氣泡出現(xiàn)為準(zhǔn)(一般凝膠電泳的電場(chǎng)強(qiáng)度不超過5V/cm)。

4、根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止(跑過膠板的2/3)。切斷電源后，再取出凝膠。

5、凝膠取出后于含EB的溶液中染色20分鐘。（三）、凝膠紫外觀察：

染色后的凝膠取出于紫外監(jiān)測(cè)儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相，保存，記錄結(jié)果。注意事項(xiàng)

1.瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高。

2.制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。

3.EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。

4.加樣時(shí)，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔