第四章免疫分析技術(shù)

第四章免疫分析技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)免疫檢測技術(shù)概述第二節(jié)四種常見免疫分析技術(shù)第三節(jié)免疫生物傳感器第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)第五節(jié)免疫親和色譜第六節(jié)免疫印跡技術(shù)第一節(jié)免疫檢測技術(shù)概述免疫檢測技術(shù)起源：檢測病原微生物抗原及抗體的血清學(xué)診斷。1896年G.Widal和A.Sicard利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效準(zhǔn)確地診斷傷寒。免疫分析法（immunoassay,IA）是利用抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生免疫復(fù)合物的原理分析微量或超微量待測物質(zhì)的一種分析手段，往往需要借助一種信號放大系統(tǒng)把抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)信息予以展現(xiàn)和放大。免疫分析技術(shù)是以抗原與抗體在體外特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。免疫分析法是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的超微量測定技術(shù)。免疫分析技術(shù)的特點高度的靈敏性：可檢測10-18~10-6級別的物質(zhì)；（免疫聚合酶鏈反應(yīng)，免疫沉淀反應(yīng)）高度的特異性：可區(qū)別物質(zhì)間細微的差異，這是其他技術(shù)無法比擬的。樣品前處理復(fù)雜操作繁瑣需要昂貴的儀器設(shè)備檢測時間長可大大簡化甚至省去復(fù)雜的樣品前處理過程操作簡便無需昂貴的儀器設(shè)備快速、靈敏、特異，可短時間檢測大量樣品與目前農(nóng)藥殘留的主要檢測方法氣相色譜分析法和高效液相色譜法等相比，免疫分析方法具有明顯優(yōu)勢。GC/HPLC法IA分析法免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)免疫反應(yīng)的動力學(xué)類型分為：競爭反應(yīng)：標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）共同競爭與抗體的反應(yīng)。

Ag（樣品）+Ab

AgAbAg*（定量加入）

+Ab

*AgAb夾心反應(yīng)：將抗體、抗原和第二抗體結(jié)合在一起，形成夾心式結(jié)合物。最終，檢測夾心結(jié)合物上標(biāo)記物，計算樣品中抗原含量。

Ab1+Ag+Ab2*Ab1-Ag-Ab1*免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)抗原和抗體在反應(yīng)中存在方式不同分為：均相分析（液相免疫分析）：不需要將游離抗原與結(jié)合物分離，直接進行測定。特點：簡單省時，適合于測定小分子化合物，靈敏度10-9g/ml；異相分析（固相免疫分析）：抗原抗體反應(yīng)后，將結(jié)合物與游離抗原（或抗體）及樣品用常規(guī)物理方法分離，然后對分離出的結(jié)合物進行檢測。特點：有較高靈敏度靈敏度10-12g/ml，干擾少。免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)標(biāo)記方法的不同分為：熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)、生物發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)，并借助熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標(biāo)檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接進行觀察或進行自動化測定。第二節(jié)四種常見免疫分析技術(shù)（1）熒光免疫分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種，是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。

1941年，Coons首次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)?；驹恚簾晒饷庖叻治龇ㄊ菍⒉挥绊懣乖贵w活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。（1）熒光免疫分析技術(shù)熒光現(xiàn)象與熒光物質(zhì)

熒光素(fluorescein):

在藍光或紫外線照射下，發(fā)出綠色熒光的一種黃色染料。用于熒光抗體技術(shù)中的熒光染料。常用的熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC），四乙基羅丹明（RB200），四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。（1）熒光免疫分析技術(shù)抗體的熒光素標(biāo)記

用于標(biāo)記的抗體要求：高特異性和高親和力；不應(yīng)含有針對標(biāo)本中正常組織的抗體；一般需經(jīng)純化提取后再作標(biāo)記。作為標(biāo)記的熒光素要求：具有能與Ab分子形成共價健的化學(xué)基團；與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率；熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明；與Ab結(jié)合后不影響Ab的生化與免疫性質(zhì)；標(biāo)記方法簡單、安全無毒；與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，不易解離，易于保存。

（1）熒光免疫分析技術(shù)直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體（1）熒光免疫分析技術(shù)間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。應(yīng)用：常用于微生物檢測，例如：沙門氏菌。在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用:熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗上已廣泛用于細菌、病毒和寄生蟲的檢驗及自身免疫病的診斷等熒光顯微鏡（2）放射免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA）定義：是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析方法，用于定量測定受檢標(biāo)本中抗原。1959年，Yalow和Berson創(chuàng)建的分析方法。基本原理：（2）放射免疫分析技術(shù)常用標(biāo)記核素：125I：γ射線，半衰期60天3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器γ計數(shù)儀β液閃儀優(yōu)點：檢測靈敏度高，高達ng~pg水平;測定的準(zhǔn)確性好，數(shù)量級的回收率接近100%.缺點：操作相對復(fù)雜，同位素半衰期短，保存及操作相對復(fù)雜。β液閃儀γ計數(shù)器（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一大新型的標(biāo)記免疫技術(shù)，這一技術(shù)的誕生被譽為免疫血清學(xué)技術(shù)的一場革命，是應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)技術(shù)之一。1971年，Engvall和Perlman首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）。由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)基本原理：利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。常用于標(biāo)記抗體的酶：酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)直接法測定抗體缺點：每檢查一種抗體需制備相應(yīng)的特異抗體。（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)間接法測定抗體優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗體的檢測中只需應(yīng)用一種酶標(biāo)抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)雙抗體夾心測定抗原（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)應(yīng)用：檢測食品中農(nóng)、獸藥殘留及微生物；還可以檢測營養(yǎng)素，例如蛋白質(zhì)、激素等。酶標(biāo)儀（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析：將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence

immunoassay,CLIA)：將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)。常用化學(xué)發(fā)光劑有直接化學(xué)發(fā)光劑和酶促反應(yīng)發(fā)光劑。直接化學(xué)發(fā)光劑：吖啶酯，三聯(lián)吡啶釕

酶促反應(yīng)發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物，AMPPD（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)基本原理：用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光-直接競爭法辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光-雙抗體夾心法幾種標(biāo)記免疫分析技術(shù)比較檢測方法檢測范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）第三節(jié)免疫生物傳感器免疫生物傳感器（immune-biosensor）是生物技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合，利用生物體內(nèi)抗原、抗體轉(zhuǎn)移性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的設(shè)備裝置。免疫傳感器分為兩類：利用競爭酶免疫反應(yīng)原理設(shè)計：例如：黃曲霉毒素傳感器：氧化極和黃曲霉抗體膜組成檢測農(nóng)、獸殘留，微生物等利用親和性設(shè)計：例如：農(nóng)獸藥品種檢測食品添加劑、營養(yǎng)素（氨基酸、脂肪酸和糖類）以及農(nóng)獸藥等污染物。免疫生物傳感器原理示意圖緩沖液抗體生物傳感和傳輸元件檢測器廢液缸計算機待測樣品（酶標(biāo)抗原）底物泵第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金（colloidalgold）是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核及包圍在外的雙例子層構(gòu)成，緊連在金核（Au）表面的是內(nèi)層負離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。免疫金：膠體金可與免疫活性物質(zhì)（抗體或抗原）結(jié)合形成膠體金結(jié)合物，常稱為免疫金復(fù)合物（肉眼可見的紅色）。第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)檢測原理：以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以微孔濾膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣品后，經(jīng)濾膜毛細管作用，使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，膠體金結(jié)合物大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，用于定性或半定量的快速免疫檢測。檢測結(jié)果以血吸蟲抗體檢測試紙條為例

第五節(jié)免疫親和色譜免疫親和色譜（Immmunoaffinitychromatography,IAC）是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結(jié)合反應(yīng)為原理的色譜技術(shù)。特點：特異性強，結(jié)合容量大，洗脫條件溫和，色譜柱可以方便地再生使用應(yīng)用：作為免疫凈化柱，適用于復(fù)雜樣本中痕量農(nóng)獸藥殘留的分離分析。步驟：加樣→洗滌→洗脫詳見下圖免疫親和色譜柱示意圖第六節(jié)免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的