《發(fā)酵工程》第2章 菌種與種子擴(kuò)大培養(yǎng)

第二章菌種與種子擴(kuò)大培養(yǎng)

掌握微生物工業(yè)對菌種的要求、了解其常用微生物工業(yè)生產(chǎn)用菌種的來源掌握生產(chǎn)菌種的保藏、選育方法及防止菌種衰退的措施了解種子擴(kuò)大的任務(wù)

掌握工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型

了解影響種子質(zhì)量的主要因素

Contents(4學(xué)時(shí))發(fā)酵工業(yè)用菌種

種子擴(kuò)大培養(yǎng)

重點(diǎn)：菌種的選育、保藏方法，防止菌種衰退的措施以及影響種子質(zhì)量的因素。種子擴(kuò)大培養(yǎng)定義

難點(diǎn)：影響種子質(zhì)量的因素。第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)用菌種

發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求工業(yè)上常用的微生物及來源生產(chǎn)用菌種的保藏及選育防止菌種衰退的措施一、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求

發(fā)酵工業(yè)用的菌種盡管多種多樣，但作為大規(guī)模生產(chǎn)，對菌種選擇要求如下：能在價(jià)格低廉的培養(yǎng)基上快速生長，大量合成目的產(chǎn)物

可以在要求不高，易于控制的培養(yǎng)條件下（糖濃度、溫度、PH、溶解氧、滲透壓等）迅速生長和發(fā)酵，以縮短發(fā)酵周期。天氣炎熱地區(qū)選擇耐高溫的菌種更為適宜根據(jù)代謝調(diào)控的要求，選擇高產(chǎn)菌株，如營養(yǎng)缺陷型突變菌株或調(diào)節(jié)突變菌株或野生菌株選擇抗噬菌體能力強(qiáng)的菌株，使其不易感染噬菌體菌種純，不易變異退化，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性不能是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保證安全

二、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代謝產(chǎn)物多，已超過1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過40－50種。微生物具有巨大的潛力可挖掘。工業(yè)上常用菌種舉例：常用的工業(yè)微生物菌種如下：細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌

1、常用的細(xì)菌大腸桿菌應(yīng)用：對谷氨酸定量分析，生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

乳酸桿菌應(yīng)用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作

枯草芽孢桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)淀粉酶2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母應(yīng)用：生產(chǎn)酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質(zhì)、生產(chǎn)脂肪啤酒酵母紅酵母面包酵母3、霉菌曲霉屬應(yīng)用：生產(chǎn)有機(jī)酸、生產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）米曲霉應(yīng)用：產(chǎn)糖化酶和蛋白酶、主要用于釀酒制曲和醬油制曲應(yīng)用：生產(chǎn)甲叉丁二酸(又名衣康酸)

毛霉應(yīng)用：可以產(chǎn)生蛋白酶，我國多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應(yīng)用：釀酒黑根霉是真菌的一種,常利用它的糖化作用,比如甜酒曲中的主要菌種就是黑根霉!黑根霉的最適生長溫度約為28℃，超過32℃不再生長青霉菌應(yīng)用：生產(chǎn)青霉素、葡萄糖氧化酶4、放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素工業(yè)用菌種的來源購買如從菌種保藏機(jī)構(gòu)或者其它研究機(jī)構(gòu)購買：CGMCC(中國普通微生物菌種保藏管理中心),隸屬中科院CMCC中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心贈(zèng)送篩選復(fù)壯三、生產(chǎn)用菌種的保藏及選育（一）菌種保藏

1、目的：提高菌種存活率，減少菌種的變異，保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。

2、原理：根據(jù)菌種的生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。

保藏時(shí)首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以達(dá)到降低其代謝活動(dòng)，延長保存期的目的。

（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏，如此反復(fù)。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單、存活率高，具有一定的保藏效果。缺點(diǎn)：菌種仍有一定的強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長，傳代多，菌種容易變異。適用菌種：細(xì)菌、酵母、防線菌、霉菌

3、菌種保藏的方法：斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍干燥法、冷凍法、液態(tài)真空干燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。（2）礦物油保藏法將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。適用菌種：適用于除細(xì)菌外的其它菌種（3）砂土管保藏法利用土壤顆粒對微生物起保護(hù)作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。適用菌種：產(chǎn)孢子的微生物，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌（奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌）以及酵母不適用。（4）真空冷凍干燥法先在菌懸液加入保護(hù)劑（如：脫脂牛奶、血清等）然后在較低溫度下使成凍結(jié)狀態(tài)，最后減壓抽干。

特點(diǎn)：它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達(dá)一年至數(shù)十年之久，并且存活率高，變異率低。單使手續(xù)麻煩，需要一定的設(shè)備。

適用菌種：對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。（5）其他保藏方法冷凍法：分低溫冷凍（－20℃）與超低溫冷凍（－196℃）兩種。適用于細(xì)菌、真菌、病毒等的保藏蒸餾水保藏法：菌體在無營養(yǎng)條件條件下4~10℃較長時(shí)間保藏。適用于酵母菌、真菌等。瓊脂穿刺封口保藏法：適用于不產(chǎn)孢子細(xì)菌的保藏曲法保藏：將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的干燥器中，干燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。麥粒保藏法：麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時(shí)，置通風(fēng)、避光、干燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。無水硅膠保藏法：將細(xì)胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，加入裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于干燥器內(nèi)，室溫或4℃保藏。對于細(xì)菌和真菌效果都較好。不同菌種采用不同保藏方法，以便長期保藏:1、酵母菌一般采用定期移植斜面低溫保藏法，將酵母接種子米曲汁或麥芽汁瓊脂斜面上，放于低溫處，每隔幾個(gè)月移植一次。酒精酵母經(jīng)過數(shù)十年的移植沒有發(fā)現(xiàn)變異或衰退現(xiàn)象。也可采用石蠟油封藏法

2、曲霉過去采用定期移植斜面低溫保藏法，但極易發(fā)生變異現(xiàn)象。產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉連續(xù)移植多次甚至不生成分生孢子或不產(chǎn)檸檬酸。而改用砂土保藏法后，變異現(xiàn)象不再發(fā)生3、絲狀真菌特別是不產(chǎn)生孢子的擔(dān)子菌，可采用液氮超低溫凍結(jié)法保藏，但需專門的液氮冰箱4、一般細(xì)菌以冷凍干燥法保藏。乳酸菌可用麥殼保藏；丙酮丁醇梭菌，可用砂土管保藏。放線菌可用砂土管或冷凍保藏法保藏國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種是一個(gè)國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有700多家菌菌種保藏機(jī)構(gòu)，其中國際知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織承認(rèn)的法定的保藏機(jī)構(gòu)僅有28家。1、我國的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)2、國外主要的微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)

1）美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）2）美國冷泉港研究所（CSH）3）日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）4）日本東京科研化學(xué)有限公司（KCC）5）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）6）英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）7）美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）8）美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（NRRL）（二）菌種選育

菌種選育

是按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)微生物的遺傳和變異的理論，用人工方法使菌種變異，再經(jīng)過篩選而達(dá)到菌種選育的目的。育種的目的:

改變菌種的特性，使產(chǎn)量提高、改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等。微生物育種的基本方法包括以下幾種類型:自然選育抗噬菌體菌株的選育誘變育種代謝調(diào)控育種基因定向育種

自然選育是指在生產(chǎn)過程中不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選的過程。

誘變育種是采用物理、化學(xué)誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，從而使細(xì)胞的功能發(fā)生改變。

微生物誘變育種的工作程序如下:

純化

細(xì)胞或孢子懸液制備

中間培養(yǎng)突變株分離

初篩

復(fù)篩生產(chǎn)性試驗(yàn)

誘變劑處理離心收集菌體

離心洗滌玻璃珠振蕩分散

過濾

原菌株（出發(fā)菌株）代謝控制育種主要有兩個(gè)方面：一方面是改變代謝通路的育種，另一方面是改變代謝自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的育種?；蛑亟M是雜交育種的基礎(chǔ)，其方法多種多樣，包括:有性雜交準(zhǔn)性雜交轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程技術(shù)

四、防止菌種退化的措施

1、菌種退化：菌種的發(fā)酵能力降低、繁殖能力降低、發(fā)酵產(chǎn)品的得率降低區(qū)別于雜菌污染：

雜菌污染引起產(chǎn)量下降和影響菌種生長，容易和菌種退化相混淆，需通過劃線分離來確定是污染還是衰退。2、菌種退化的原因：一、菌種保藏不妥；二、菌種生長的要求沒有得到滿足；

經(jīng)誘變得來的突變株由于發(fā)生回復(fù)突變，也會(huì)喪失新的特性。3、防止菌種退化的方法：

做好菌種保藏以保持菌種的優(yōu)良特性滿足菌種生長要求，減少傳代次數(shù)對已衰退的菌株進(jìn)行分離、復(fù)壯4、菌種復(fù)壯方法①純種分離法；②淘汰已衰退的個(gè)體③采用其它方法：誘變因素處理，再進(jìn)行單菌落分離；選擇合適的培養(yǎng)基

第二節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在沙土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接到試管斜面活化后，再經(jīng)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。這些純培養(yǎng)物則稱為種子。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)

◆任務(wù)：不僅要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。以便在發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)過程中盡可能地縮短遲滯期。◆根據(jù)菌種生長速度快慢來決定擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)；※細(xì)菌（谷氨酸及其它氨基酸生產(chǎn)）生長較快，用二級放大培養(yǎng)（斜面菌種→一級種子搖床培養(yǎng)→二級種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐）※放線菌（生產(chǎn)抗生素）生長繁殖速度較慢，常常用三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)（其中鏈霉素須四級擴(kuò)大）：即斜面菌種→一級種子搖床培養(yǎng)→二級（?。┓N子罐培養(yǎng)→三級（較大）種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐，一般50噸發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵。有些酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)也采用三級發(fā)酵。二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型

工業(yè)微生物的培養(yǎng)方法兩大類型（1）靜置培養(yǎng)法（厭氣性發(fā)酵）例如：酒精、丙酮、丁醇、乳酸等發(fā)酵均屬于此類型。

（2）通氣培養(yǎng)法（好氣性發(fā)酵）。例如；氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸和酶制劑等發(fā)酵均屬此類型。用作種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法又可分為：液體培養(yǎng)法：三角瓶搖床振蕩或回轉(zhuǎn)式培養(yǎng)。

表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)，菌體生長在培養(yǎng)基表面。

固態(tài)培養(yǎng)法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等固體培養(yǎng)基（如麩皮）培養(yǎng)。大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)方法及特點(diǎn)：園盤制曲機(jī)（園盤固體發(fā)酵機(jī)）A、固體培養(yǎng)（曲法培養(yǎng)）淺盤固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)B、液體培養(yǎng)淺盤液體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)：

目前幾乎所有的好氣發(fā)酵均采用液體深層發(fā)酵法；C、載體培養(yǎng)：用天然（或人工）多孔材料（如脲脘泡沫塑料）代替麥麩之類固態(tài)基質(zhì)作微生物生長的載體，營養(yǎng)成分可嚴(yán)格控制。D、兩步法液體深層培養(yǎng)：在酶制劑和氨基酸生產(chǎn)中應(yīng)用較多?？刂凭w在不同生長期的條件。（營養(yǎng)生長與代謝產(chǎn)物積累時(shí)條件不同）操作：菌種先在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上大量繁殖→收集菌體濃縮物→洗滌→添加誘導(dǎo)物的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)特點(diǎn)：將菌體生長條件（營養(yǎng)期）與產(chǎn)酶條件（自我繁殖期）區(qū)分開來。eg:

酶制劑兩步法液體深層培養(yǎng)第一步是屬有機(jī)酸發(fā)酵或氨基酸發(fā)酵。第二步是在微生物產(chǎn)生的某種酶作用下把第一步產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為所需的氨基酸所以又稱為酶轉(zhuǎn)化法，eg:氨基酸生產(chǎn)的兩步法液體深層培養(yǎng)：工藝繁雜，目前谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸等大多數(shù)是利用直接發(fā)酵來生產(chǎn)的三、影響種子質(zhì)量的主要因素1、培養(yǎng)基：主要是碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素和水等。

選用原則：組分簡單，來源豐富，價(jià)格便宜，取材方便等。種子培養(yǎng)基是培養(yǎng)菌體的（以菌體增殖為主要目的），應(yīng)該是糖份少而氮源多些。但種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分趨于一致時(shí)，可縮短發(fā)酵生產(chǎn)的周期，但在各成分的數(shù)量（原料配比上），應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定。2、種齡與接種量對數(shù)生長期為宜，種齡過嫩或過老，都會(huì)延長發(fā)酵周期，降低產(chǎn)量。一般以5~10%為宜。3、溫度：溫度直接影響生長和酶的合成

夾套、排管或蛇管，冬季進(jìn)風(fēng)還要加熱

當(dāng)公稱容積在6M3以下時(shí)罐采用夾套式。發(fā)酵氣的冷卻或加熱，均由夾套來完成。公稱容積為6M3以上時(shí)，發(fā)酵氣的冷卻由立式排管來擔(dān)負(fù)發(fā)酵罐內(nèi)排管4、pH值：對