丙型肝炎實驗室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

丙型肝炎實驗室診斷技術(shù)

研究進(jìn)展丙型肝炎呈全球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。全球HCV的感染率約為3％，每年新發(fā)HCV病例約315萬例，我國人群抗-HCV陽性率為3.2％，近4千萬感染者。以長江為界，北方(3.6％)高于南方(2.9％)。目前尚無有效疫苗用以預(yù)防丙型肝炎。母嬰傳播率不超過6％。HCV是單鏈RNA病毒，包含約9600個堿基。HCV包含至少6種主要的基因型和大量的基因亞型。每種基因型的氨基酸順序差異約為30％。按照國際通行的方法，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示HCV基因型，以小寫的英文字母表示基因亞型(如1a、2b等)?；蛐偷姆植即嬖诘貐^(qū)差異?；?型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。在我國大陸地區(qū)，以1b、2a型為主，輸血途徑感染者多為1b型，在歐洲和日本以1b型為主，中東地區(qū)以4型常見，6型主要見于香港和澳門地區(qū)?；蛐偷囊饬x在于其與抗病毒治療效果的相關(guān)性十分密切。1.抗HCV抗體檢測1.1ELISA目前臨床診斷和采供血機(jī)構(gòu)多采用第三代ELISA試劑，其在第二代試劑的基礎(chǔ)上增加了非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3區(qū)C33C抗原的比例，且采用基因重組技術(shù)、抗原純度和活性提高，靈敏性、特異性均有較大提高。1.2膠體金法(PA)

原理：將膠體金結(jié)合HCV重組抗原固相于玻璃纖維上，待測樣本中抗-HCV與之反應(yīng)形成復(fù)合物，后者向上移動被固定于硝酸纖維素膜上的HCV抗原捕獲，形成一條陽性色帶，15min即可判斷結(jié)果。優(yōu)點：該方法操作簡單、無需特殊實驗條件及儀器設(shè)備，靈敏度及特異性均較高，對丙型肝炎的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防控制有重要參考價值。1.3化學(xué)發(fā)光技術(shù)(CLIA)是化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種檢測方法，可行抗-HCV定性、定量檢測，靈敏度、準(zhǔn)確性較高，且可避免放射污染，臨床應(yīng)用趨于廣泛。1.4重組免疫印跡實驗(RIBA)利用基因重組技術(shù)和包被技術(shù)將HCV不同重組抗原片段包被于醋酸纖維薄膜條帶的不同位置，待測樣本中抗-HCV與之結(jié)合后產(chǎn)生色帶。第一代RIBA試劑含有C100-3、5-1.1兩種抗原(包括SOD序列)，與ELISA相比特異性明顯提高，但靈敏度降低；第二代RIBA試劑在第一代基礎(chǔ)上增加了3個重組多肽，靈敏度和特異性均有較大提高，是抗-HCV確證的金標(biāo)準(zhǔn)；第三代mBA在第二代基礎(chǔ)上增加了NS5區(qū)抗原，可用于對第二代RIBA結(jié)果不確定標(biāo)本的確證。2HCV核酸檢測

2.1HCV-RNA定性、定量檢測①PCR：是一種模擬體內(nèi)天然DNA復(fù)制過程的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。RT-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄和cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。檢測低限為50～100IU/ml。臨床PCR單項陽性結(jié)果即可確診HCV感染。②支鏈DNA(bDNA)技術(shù)：是一種不依賴PCR的核酸放大定量方法。bDNA分支可結(jié)合RNA與包被于固相板上的探針雜交，固定后加入多個靶探針分別與HCVRNA5’非編碼區(qū)和核心抗原區(qū)的不同位點雜交使信號放大數(shù)十倍，加入bDNA擴(kuò)增后可與各靶探針結(jié)合，使每個核酸信號得以放大數(shù)百倍，通過底物發(fā)光檢測。bDNA技術(shù)的優(yōu)點是放大倍數(shù)確定、重復(fù)性好，可用于HCVRNA的動態(tài)變化研究，但其檢測限高于RT-PCR方法。③轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增術(shù)(TMA)：特點是利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶2種酶的共同作用。優(yōu)點為整個反應(yīng)在一個試管中進(jìn)行，顯著減少了污染的可能。與RT-PCR比較定性檢測低限更低。2．2HCVRNA基因型檢測HCV可分為6種主要基因型及11個主要亞型。①限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP)：是較早出現(xiàn)的分型方法，其利用RT-PCR擴(kuò)增具有不同酶切位點的各種HCV基因型，PCR產(chǎn)物被3～5種不同的限制性內(nèi)切酶消化后，將電泳結(jié)果與已知限制性片段數(shù)據(jù)庫比較確定其基因型。PCR-RFLP擴(kuò)增的區(qū)域可以是5’UTR、核心區(qū)及NSSB。但RFLP由于其檢測準(zhǔn)確性低、成本高等原因，臨床應(yīng)用較少。②反相線性探針雜交法(Li-PA)：基于反相雜交原理，通過生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增HCV5’UTR，產(chǎn)物變性后與硝酸纖維膜上基因型特異探針雜交，加入堿性磷酸酯酶和顯色底物BT/BCIP后可顯現(xiàn)紫色或棕色條帶。該技術(shù)檢測成本低，與金標(biāo)準(zhǔn)一致性很高，應(yīng)用前景較好。③測序法：原理是擴(kuò)增HCV基因組種系信息區(qū)(NS5B、核心區(qū)或E1)并測序，將結(jié)果與已知基因型序列比較從而判斷基因型，是HCV基因型檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。該法成本較高，臨床應(yīng)用較少，但在流行病學(xué)研究和亞型檢測中能提供更全面的信息。④基因芯片技術(shù)：基本原理是將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣本分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度獲取樣本分子的數(shù)量和序列信息。該技術(shù)應(yīng)用廣泛，可一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，操作簡單、自動化程度高。3HCV抗原檢測

HCV核心抗原(HCV-cAg)與HCVRNA的動力學(xué)變化密切相關(guān)，可作為HCV復(fù)制的標(biāo)志。HCV-cAg氨基酸序列保守，是目前HCV抗原檢測的主要目的抗原片段。血清中HCV抗原含量很低，用常規(guī)ELISA等方法很難檢出。近幾年來，靈敏、可定量且適合自動化檢測的HCV抗原檢測試劑已經(jīng)研發(fā)成功，有望進(jìn)入臨床實驗室。另外，HCV-cAg存留時間短(27～70d)，結(jié)果判定還應(yīng)結(jié)合抗-HCV檢測情況。4其他檢測技術(shù)

4.1蛋白芯片技術(shù)原理：先獲取HCV融合抗原及分片段抗原，點樣于醛基化玻片等載體上，制成HCV不同片段抗體蛋白芯片，待測樣本加入芯片后發(fā)生免疫反應(yīng)，利用熒光或酶顯色進(jìn)行檢測。優(yōu)點：該法不僅能檢測血清中有無HCV抗體，還能同時檢測血清或血漿中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNs5及抗HCV總抗體5項指標(biāo)，具有自動快捷、靈敏特異、高通量等特點。4.2環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)