多沙唑嗪對映體在動物心血管系

多沙唑嗪對映體在動物心血管系統(tǒng)的手性藥理學研究研究生姓名：孫家安導師：任雷鳴教授引言多沙唑嗪（doxazosin，DOX）最早由Pfizer制藥公司研制成功并于1988年首先在丹麥上市喹唑啉環(huán)衍生物,選擇性α1受體阻斷劑同時擴張阻力血管和容量血管臨床應用良性前列腺增生患者下尿路癥狀降低血壓對血脂代謝有良好的改善作用明顯降低血漿甘油三酯和總膽固醇水平，能降低低密度脂蛋白、提高高密度脂蛋白膽固醇水平，使HDL/LDL和（HDL-C）/TC比值顯著升高，減少血管壁的膠原合成，明顯降低冠狀動脈疾病的易患性和危險性DOX的意外退出多沙唑嗪提前退出抗高血壓和降脂治療預防心肌梗死的大規(guī)模臨床試驗（ALLHAT）α受體阻斷劑也因此退出了高血壓治療的一線用藥（JNC7)DOX是否會導致心力衰竭及致心衰作用是否源于其α受體阻斷作用一直飽受爭議最近的大規(guī)模臨床研究又發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪作為追加用藥用于治療高血壓病不會增加心力衰竭的發(fā)病率(ASCOT)目前DOX作為高血壓治療的輔助用藥仍然在臨床得到廣泛的應用，尤其適用于同時合并有高血壓及BPH患者的治療多沙唑嗪對映體多沙唑嗪存在一對對映體[(-)DOX與(+)DOX]，而目前應用于臨床的是其外消旋體[(±)DOX]。生物體內廣泛存在具有手性識別能力的生物大分子，當手性藥物與其相互作用時將產生立體選擇性的不同效應，從而體現(xiàn)不同的藥效學和藥代動力學特征。因此，DOX對映體在生物體內的立體選擇性研究有著重要的科學價值和現(xiàn)實應用意義。在不同組織的立體選擇性前列腺組織的選擇性，(-)DOX、(+)DOX及(±)DOX三者的pA2值相近(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX拮抗苯腎上腺素誘發(fā)兔膀胱逼尿肌收縮反應的pKB

值相近(-)DOX在兔離體胸主動脈、頸總動脈、耳動脈、腸系膜動脈和肺動脈五種血管標本上血管平滑肌α1受體的拮抗參數(shù)均明顯小于(+)DOX我們研究了(±)DOX及其兩種對映體對離體心房心肌收縮力和心率的影響，并與同樣是喹唑啉類高選擇性α受體阻斷藥的阿夫唑嗪（alfuzosin，ALF）及其對映體做了對比。心功能受損時導致激素與促炎細胞因子分泌腦利鈉肽（BNP）、核因子-κB（NF-κB）及白細胞介素-6（IL-6）均是心力衰竭發(fā)生的血清生物學標志物。BNP是在心室張力增加時主要由心室分泌的一種激素物質，具有利尿利鈉的作用。NF-κB是廣泛存在于體內的一種轉錄因子，主要調控炎癥介質及免疫反應基因的表達。多種病因心力衰竭患者的體內均可發(fā)現(xiàn)存在NF-κB的激活。IL-6是一種重要的炎癥介質，其血清濃度也與心力衰竭心肌收縮力有相一定關系。DOX對心肌收縮力影響的機制DOX對映體的α受體阻斷外作用蛋白激酶C通過激活Na+/K+ATP酶、肌鈣蛋白和ATP敏感鉀通道，降低心肌收縮力磷脂酶C的使二磷酸磷酯酰肌醇(PIP2)磷酸化產生三磷酸肌醇（IP3），刺激大鼠心肌收縮。NO可活化鳥苷酸環(huán)化酶，通過cGMP-PKG信號途徑調控心肌細胞的L型鈣通道，產生抑制心肌收縮力的作用。而cAMP也參與了藥物誘導大鼠心肌正性肌力作用的機制。血漿蛋白結合研究的意義藥物與血漿蛋白結合的變化顯著影響其藥代動力學和藥效學。對映體蛋白結合率的不同往往是它們藥代動力學差異的原因之一。對映體蛋白結合的立體選擇性研究是明確其藥理學效應、臨床療效及安全性必不可少的內容。我室研究發(fā)現(xiàn)多沙唑嗪對映體對心肌收縮力具有相反的作用，且服用消(±)DOX后兩對映體的血藥濃度不同有必要對多沙唑嗪對映體蛋白結合的立體選擇性進行研究。研究內容多沙唑嗪對映體對心率、心肌收縮力及心衰生物學標志物的影響多沙唑嗪對映體在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結合率研究多沙唑嗪對映體誘發(fā)大鼠心房肌收縮力變化的作用機制第一部分

多沙唑嗪對映體對心率、心肌收縮力及心衰生物學標志物的影響

研究內容本研究采用小鼠離體心房組織，觀察(±)DOX及其兩種對映體、(±)ALF及其兩種對映體對小鼠離體心房心肌收縮力和心率的影響觀察長期給予多沙唑嗪及其對映體對大鼠血漿氨基末端腦鈉肽前體（amino-terminalpro-brainnatriureticpeptide，NT-proBNP）、IL-6及NF-κB水平的不同影響。

材料與方法

儀器FA2004型電子天平

SC-15數(shù)控超級恒溫槽

BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)

YSD-4G藥理生理實驗多用儀DNM-9602酶標儀白洋B600B臺式低速離心機

藥品

甲磺酸消旋多沙唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司甲磺酸左旋多沙唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司甲磺酸右旋多沙唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司甲磺酸消旋阿夫唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司甲磺酸左旋阿夫唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司甲磺酸右旋阿夫唑嗪

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司NT-proBNP檢測試劑盒

上海源葉生物有限公司NF-κB檢測試劑盒

上海源葉生物有限公司Interleukin-6檢測試劑盒

上海源葉生物有限公司實驗動物

KM小鼠，雄性，體重35~45g；SD大鼠，雄性，300~320g，均由河北省實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于室溫23℃±1℃，相對濕度50±5%，明暗各12小時的清潔級動物實驗室內，自由進食和飲水。

標本的制備

右心房（含竇房結）標本以25%烏拉坦（1.5g·kg-1）腹腔注射麻醉動物后，經頸動脈放血處死動物。小鼠處死后，迅速開胸，剪斷與心臟相連大血管，取出心臟置于95%O2+5%CO2預飽和的冷Krebs溶液中，沿房室溝剪去心室，小心剪下右心房（勿損傷竇房結）。在右心房兩端尖部各系一絲線，一端固定于麥氏浴槽底部，另一端連接張力換能器，并通過生物機能實驗系統(tǒng)（BL-420E+）記錄右心房自發(fā)性收縮反應。麥氏浴槽內盛有10ml的Krebs溶液，持續(xù)充以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持溫度37±0.25℃。初始前負荷0.8g，10min后以0.1g單位逐步升高前負荷，直至標本的收縮反應達到最適狀態(tài)。平衡1h，其間每20min換液一次。標本平衡1h后開始實驗。

左心房標本

同法取出心臟標本，沿房室溝剪去心室，小心剪下左心房。在左心房兩端尖部各系一絲線，一端固定于帶有刺激電極的支架上，置于麥氏浴槽底部，另一端連接張力換能器。初始前負荷0.5g，標本平衡30min后，電刺激（波寬2ms，頻率4Hz，120%閾電壓）驅動左心房肌收縮，并通過生物機能實驗系統(tǒng)（BL-420E+）記錄心肌收縮時的張力變化。電刺激期間，以0.1g單位逐步升高前負荷，直至標本的收縮反應達到最適狀態(tài)。麥氏浴槽內盛有10mlKrebs溶液，連續(xù)充以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持溫度在37±0.25℃。電刺激1h后開始實驗。

實驗分組和處理

(±)DOX和(±)ALF及二者的對映體對小鼠離體右心房心率的影響

實驗分七組，即(-)DOX、(+)DOX、(±)DOX、(-)ALF、(+)ALF、(±)ALF組和溶劑對照組。六個藥物的濃度均配制成2mmol·L-1。按照3、10和30μmol·L-1的終濃度，采用累積給藥法加入浴槽中，每個標本只給予一種藥物。溶劑對照組同法給予等容積的蒸餾水。記錄實驗數(shù)據時，對于給藥后出現(xiàn)停博的標本不再計數(shù)心率；其他標本均按實際標本數(shù)計數(shù)心率指標。以第一次給藥前10s內的平均心率作為藥前值；每次給藥后，記錄藥后第20min時10s內的平均心率作為藥物的效應。

實驗分組和處理

(±)DOX和(±)ALF及二者的對映體對小鼠離體左心房心肌收縮力的影響電刺激1h后，開始實驗。實驗分組、藥物配制、給藥方法同小鼠離體右心房實驗。記錄實驗數(shù)據時，以第一次給藥時的前3s內平均收縮張力作為藥前值；給藥后，記錄藥后第20min時3s內的平均收縮張力作為藥物的反應。

實驗分組和處理

(±)DOX及其對映體12周連續(xù)灌胃給藥對大鼠血漿NT-proBNP、NF-κB及IL-6的影響SD大鼠40只，按體重隨機分為溶劑對照組、(-)DOX組、(+)DOX組、(±)DOX組，每組10只。溶劑對照組灌服等容量蒸餾水，給藥組均給予相應的藥物（8mg·kg-1），給藥容積10ml·kg-1。每周固定時間稱大鼠體重一次，根據新的體重調整給藥劑量。每周給藥7天，連續(xù)12周。末次給藥前大鼠禁食12小時，給藥后8小時，戊巴比妥鈉（50mg·kg-1）皮下注射麻醉大鼠，沿腹白線切開大鼠腹部，小心剝離，暴露大鼠腹主動脈,采用一次性使用靜脈采血針及生化管（含肝素抗凝劑）收集大鼠血液5mL，-20℃保存，離心3000轉，10分鐘，分離血漿，保存于-20℃冰箱。

指標檢測

酶聯(lián)免疫吸附實驗法測定NT-proBNP、NF-κB及IL-6濃度。從室溫放置20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設置標準品孔和樣本孔。標準品孔各孔加入不同濃度的標準品50μL；樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；標準品和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL。用封板臘封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60min；棄去液體，吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min；甩去洗滌液，吸水紙拍干，反復5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；每孔再加入終止液50μL；15min內，在450nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。在EXCEL工作表中，以標準品濃度作橫坐標，以OD值作縱坐標，繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度。

統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據以實測值和變化率的mean±SD表示。同一藥物不同濃度間的顯著性檢驗采用單因素方差分析和Dunnett'stest；兩組間實驗數(shù)據的比較采用組間t檢驗。血漿指標的顯著性檢驗采用單因素方差分析和Bonferroni'stest。統(tǒng)計學分析及圖形處理使用GraphPadPrismversion5.00軟件（SanDiegoCaliforniaUSA）。結

果

Cardiacarrestofisolatedmouserightatriuminducedbydoxazosin,alfuzosinandtheirenantiomersGroupsnCardiacarrestnumbers/Preparationnumbers3μmol·L-110μmol·L-130μmol·L-1Doxazosin(-)Doxazosin

120/12(0)0/12(0)1/12(8.3)

(+)Doxazosin160/16(0)0/16(0)5/16(31.3)(±)Doxazosin120/12(0)1/12(8.3)1/12(8.3)Alfuzosin(-)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(+)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(±)Alfuzosin120/12(0)0/12(0)0/12(0)Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Concentration(μmol·L-1)Heartrate(beats·min-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0346.67±38.46348.33±33.53366.25±34.03356.67±44.183333.33±33.39300.00±42.64230.00±82.30**293.33±35.51*(-3.51±7.16)(-13.63±12.73)＃＃(-38.90±22.13)△△(-16.98±11.34)△△＃＃10338.33±39.50218.33±82.00**143.75±77.71**174.55±57.33**(-2.26±7.12)(-35.19±25.35)△△＃＃(-61.30±20.96)△△(-50.26±18.18)△△30335.00±36.31172.73±80.63**61.82±47.71**89.09±45.92**(-3.15±6.44)(-45.09±34.69)△△＃＃(-83.47±12.23)△△(-74.97±15.66)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmouserightatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=11.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△△

P<0.01vscontrol,＃＃P<0.01vs(+)doxazosin.

Effectsofalfuzosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmoucerightatrium

ConcentrationHeartrate(beats·min-1)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0346.67±38.46328.00±34.25360.00±48.07340.00±22.563333.33±33.39314.00±28.36342.00±50.29330.00±31.33(-3.51±7.16)(-3.68±10.08)(-4.91±6.82)(-2.96±6.14)10

338.33±39.50298.00±30.48326.00±38.93320.00±33.03(-2.26±7.12)(-8.73±8.71)

△(-9.03±7.30)△(-5.85±7.55)30335.00±36.31282.00±25.73**306.00±32.73*305.00±34.25*(-3.15±6.44)(-13.05±7.27)△△(-14.27±9.75)

△△(-10.32±7.75)△△Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10~12.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,

△△P<0.01vscontrol.ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0120.00±32.66123.00±32.34135.00±27.59126.00±33.733116.00±34.71148.00±36.45126.00±28.36147.00±65.84(-3.80±6.87)(21.56±17.28)△△(-6.86±10.27)(14.33±27.98)△10118.00±46.62205.00±54.21**119.00±31.43160.00±55.38(-4.06±11.87)(67.59±25.32)△△#(-12.39±13.69)△(28.01±37.82)△△30114.00±35.34307.00±82.87**114.00±30.98220.00±72.72**(-5.71±5.07)(151.51±49.05)△△##(-15.89±12.98)△△(78.43±58.68)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersoncontractileforceintheisolatedmouceleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vs(±)doxazosin.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0120.00±32.66122.00±46.62117.00±26.69129.00±33.813116.00±34.71121.00±48.18115.00±31.71121.00±33.48(-3.80±6.87)(-1.43±9.55)(-1.75±12.86)(-6.47±3.80)10118.00±46.62117.00±44.73114.00±28.36121.00±38.43(-4.06±11.87)(-3.69±10.21)(-1.07±19.12)(-6.70±10.42)30114.00±35.34120.00±49.22115.00±25.50125.00±33.42

(-5.71±5.07)(-2.08±10.87)(-0.67±14.55)(-2.96±7.38)EffectsofalfuzosinanditsenantiomersoncontractileforceinthemouceisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.Concentration(ng·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)DoxazosinNT-proBNP475.55±150.21635.00±343.52*375.55±127.09424.12±134.19NF-κB

888.46±343.36705.77±193.34*1140.00±365.26910.38±276.39IL-648.81±23.3975.13±21.5859.44±23.1770.19±37.44EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonplasmaNT-proBNP,NF-κBandIL-6levelsintheratDatawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05vs(+)doxazosin.小結

DOX對小鼠離體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應；DOX的手性結構對其上述活性具有明顯的影響。ALF僅輕度抑制小鼠心率，ALF的手性結構對其心臟效應無明顯影響。長期灌胃給予DOX及其對映體未顯著影響大鼠心衰生物學標志物NT-proBNP及IL-6的血漿濃度；但是，(+)DOX組大鼠的血漿NF-κB水平顯著高于(-)DOX組，提示(+)DOX對機體免疫及炎癥反應有一定的影響。第二部分

多沙唑嗪對映體誘發(fā)大鼠心房肌收縮力變化的作用機制

ALLHAT實驗中，DOX組具有較高的心血管事件，尤其是誘發(fā)充血性心力衰竭，因此使α受體阻斷劑退出了高血壓治療的一線用藥。然而在正常生理狀態(tài)下，對于心肌收縮力而言α1受體的影響相對于β受體微不足道我們實驗室首次證實了DOX分子結構中的手性碳原子，對其對映體阻斷兔前列腺平滑肌功能性α1A受體的活性無影響；但是顯著影響了其對映體阻斷大鼠主動脈功能性α1D受體的活性。DOX兩對映體在大鼠離體心房肌標本，產生了非α1受體介導的、完全相反的兩種變力效應。

有研究發(fā)現(xiàn)(+)DOX可誘導心肌細胞凋亡，使心肌細胞數(shù)減少，并且這種作用與藥物阻斷α受體無關。Lee等發(fā)現(xiàn)，(+)DOX可抑制房室結組織的I(Ca，L)電流，致心律失常發(fā)生；而同為喹唑啉類的α受體阻斷藥bunazosin無此作用。在前述研究中，我們再次證實，(+)DOX對小鼠離體心房的心率和心肌收縮力具有明顯的影響，高濃度尚可誘發(fā)心臟停博反應；DOX的手性結構對其上述活性具有明顯的影響。相反，同為喹唑啉類的α1受體阻斷劑阿夫唑嗪的手性結構對其心臟效應無明顯影響。有關(+)DOX產生的非α1受體介導的心臟作用，國際上已有一些文獻報道

建立了(-)DOX誘發(fā)的大鼠離體左心房正性肌力模型以及(+)DOX誘發(fā)的大鼠離體左心房負性肌力模型；酚芐明阻斷α1受體和α2受體、阿托品阻斷M膽堿受體、普萘洛爾阻斷β受體、吲哚美辛阻斷前列腺素合成、維拉帕米阻斷L-型鈣通道、亞甲藍抑制可溶性鳥苷酸環(huán)化酶、H-89抑制cAMP依賴性蛋白激酶等條件下，DOX對映體誘發(fā)大鼠心房肌正性肌力作用或負性肌力作用的機制。本部分的研究內容材料與方法

FA2004型電子天平

上海良平儀器儀表有限公司SC-15數(shù)控超級恒溫槽

寧波天恒儀器廠BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)

成都泰盟科技有限公司YSD-4G藥理生理實驗多用儀

安徽蚌埠醫(yī)學院無線電二廠PHS-3C數(shù)字酸度計

杭州東星儀器設備廠50μl微量進樣器

上海醫(yī)療激光儀器廠石英亞沸高純水蒸餾器（SYZ-B）

江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司YQY–12型氧氣減壓器

上海減壓器廠有限公司儀器

藥品配制精確稱取左旋多沙唑嗪以及右旋多沙唑嗪，加適量雙蒸水定容，超聲20min。溶液儲存于棕色瓶中，置陰暗干燥處保存?zhèn)溆?。營養(yǎng)液的配制Krebs營養(yǎng)液的成份為（mmol·L-1）：NaCl118.3、KCl4.6、CaCl22.5、MgSO41.2、NaH2PO41.0、NaHCO325.0、glucose11.1。除NaHCO3、CaCl2和glucose于實驗前臨時加入外，其他成份均配成高濃度母液并于臨用前稀釋至所需濃度。配制好的營養(yǎng)液以95%O2+5%CO2的混合氣體充分飽和后，用鹽酸調pH值至7.4。實驗動物Wistar大鼠，雄性，250~350g/只，由河北省實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于室溫23℃±1℃，相對濕度50±5%，明暗各12小時的清潔級動物實驗室內，自由進食和飲水。

以25%烏拉坦（1.5g?kg-1）腹腔注射麻醉動物后，經頸動脈放血處死動物。動物處死后，迅速打開胸腔，剪斷與心臟相連大血管，取出心臟置于95%O2+5%CO2預飽和的4℃Krebs溶液中，沿房室溝剪去心室，小心剪下左心房。在左心房兩端尖部各系一絲線，一端固定于帶有刺激電極的支架上，置于麥氏浴槽底部；另一端連接張力換能器。麥氏浴槽內盛有10mlKrebs溶液，標本持續(xù)通以95%O2+5%CO2的混合氣體，維持浴槽溫度在37±0.25℃。初始前負荷0.5g，標本平衡30min后，電刺激（波寬2ms，頻率4Hz，120%閾電壓）驅動左心房肌收縮，通過生物機能實驗系統(tǒng)（BL-420E+）記錄心肌收縮時的張力變化。電刺激期間以0.1g單位逐步升高前負荷，直至標本的收縮反應達到最適狀態(tài)，1小時后開始實驗。實驗方法

阿托品及普萘洛爾對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入10-6mol?L-1的阿托品和10-5mol?L-1的普萘洛爾，分別阻斷M膽堿受體和β受體；阿托品及普萘洛爾與標本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。以第一次給予DOX時的前3s內平均肌張力作為藥前值；每次給予DOX后，記錄藥后第20min時3s內的平均肌張力作為藥物的反應。實驗設計

酚芐明對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入10-5mol?L-1的酚芐明，阻斷α受體；酚芐明與標本作用10min后，用營養(yǎng)液反復沖洗標本7~8次，將營養(yǎng)液中的酚芐明沖洗干凈；待標本平衡后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。實驗數(shù)據的記錄同前。

吲哚美辛對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入10-6mol?L-1吲哚美辛（環(huán)氧合酶抑制劑），抑制前列腺素（PG）合成；吲哚美辛與標本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。

維拉帕米對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入5×10-6mol?L-1維拉帕米，阻斷Ca2+通道；維拉帕米與標本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。

亞甲藍對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入10-5mol?L-1亞甲藍（可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制），抑制環(huán)鳥苷酸（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP）生成；亞甲藍與標本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。

H-89對DOX對映體改變大鼠心房收縮力的影響標本刺激30min后加入10-6mol?L-1的H-89，抑制cAMP依賴性蛋白激酶（cyclicAMP-dependentproteinkinase，PKA）；H-89與標本作用10min后分別加入3、10、30μmol?L-1的(-)DOX或(+)DOX，每個標本只給予一種藥物，溶劑對照組給予等體積蒸餾水。

實驗數(shù)據以實測值和變化率的mean±SD或mean±SEM表示。同一藥物不同濃度間的顯著性檢驗采用單因素方差分析和Dunnett‘stest。兩條濃度-反應量效曲線之間的比較，采用雙因素方差分析，當F值有顯著性（P<0.05）時，進一步采用Bonferroni’stest比較兩對應點間的差異。統(tǒng)計學分析及圖形處理均使用GraphPadPrism5.0軟件。統(tǒng)計學處理結

果

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.71±29.36215.71±39.52235.71±71.61

3

214.29±46.14245.71±44.29195.71±58.27(-5.70±9.91)(15.57±20.95)△(-15.61±14.15)△10225.71±64.51314.29±90.34*145.71±69.97*(0.59±18.94)(46.96±39.77)△(-36.99±23.58)30218.57±43.37357.14±68.49**△△57.14±41.12**△△(-3.62±9.24)(67.46±30.09)△△(-57.48±56.01)△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheratisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=7.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.33±24.37206.67±41.31215.00±25.103

219.26±38.42231.67±47.50200.00±64.19(-5.65±9.18)(13.02±16.66)(-8.02±21.43)10219.25±51.33305.00±37.82**△168.33±53.07(-2.19±15.67)(53.65±41.02)△△(-21.60±21.50)

30222.67±60.11338.33±64.01**△△81.67±59.47**△△(-4.67±8.66)(70.87±52.66)△△(-63.75±24.14)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithatropineandpropranololPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0223.28±37.25221.67±42.62211.67±42.623

213.75±38.54255.00±74.77175.00±46.80(-4.95)±12.18(13.71±14.39)(-14.08±23.48)10211.29±60.77300.00±64.19△131.67±39.20*△(-2.89±28.22)(35.48±11.90)△△(-33.08±17.85)△30219.27±55.05371.67±60.80**△△81.67±37.64**△△(-4.39±9.78)(71.62±37.20)△△(-60.73±17.21)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithphenoxybenzaminePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0237.52±27.22211.67±39.20210.00±36.883

220.00±36.44250.00±33.47188.33±49.56(-3.56)±9.18(19.05±7.14)(-10.40±14.76)10221.25±50..05315.00±80.68**△△161.67±69.40(-3.23±18.34)(49.27±28.71)

△△(-23.73±26.18)30229.00±60.09353.33±41.79**△△70.00±20.00**△△

(-7.23±8.87)(71.21±35.57)△△(-65.63±6.52)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithethanolPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0216.67±35.02251.67±55.29246.67±46.763

220.00±38.99296.67±43.20△226.67±45.46(1.65±10.94)(19.87±13.06)△(-7.23±13.39)10218.33±31.88386.67±66.83**△△165.00±49.70*(1.10±6.54)(55.73±18.00)△△(-31.33±18.74)△△30206.67±38.30396.67±88.92**△△73.33±29.44**△△(–4.73±8.62)(60.25±35.25)△△(-70.42±8.90)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithindomethacinPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

(-)DOX明顯增強離體小鼠左心房肌條的收縮力，本研究中(-)DOX對大鼠離體左心房肌條的收縮力有同樣的作用。(-)DOX增強大鼠心房肌收縮力的作用與α受體無關。此前也曾有文獻報道DOX及哌唑嗪可誘導體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞的凋亡，并且這種誘導作用與α受體阻斷作用無關。心臟的M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶可能未參與(-)DOX的正性肌力作用。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0176.25±72.30141.25±41.55187.50±95.883162.50±70.05172.50±43.34162.5±71.26(-10.12±10.33)(24.81±20.49)△△(-9.60±17.19)10152.50±65.63248.75±79.54**△118.75±57.93(-14.51±7.16)(75.98±23.00)△△(-33.47±9.43)△30152.50±58.25323.75±87.82**△△45.00±19.27**△△(-13.53±8.35)(131.15±17.56)△△(-72.23±14.65)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithverapamilPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=8.

**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

Ca2+拮抗劑維拉帕米預處理標本使大鼠左心房標本的心肌收縮力減弱，提示細胞外Ca2+內流以及細胞內Ca2+釋放參與了大鼠左心房標本的心肌收縮反應。盡管30μmol?L-1(-)DOX對維拉帕米預處理大鼠心肌標本的收縮力增強百分比，顯著強于其對正常且未經處理大鼠心肌標本的作用；但是，3、10和30μmol?L-1(-)DOX誘發(fā)兩種不同處理標本的正性肌力作用分別為（172.50±43.34mg）、（248.75±79.54mg）、（323.75±87.82mg）和（245.71±44.29mg）、（314.29±90.34mg）、（357.14±68.49mg）。因此，我們認為維拉帕米對(-)DOX的正性肌力作用有一定的拮抗效應；但是隨著(-)DOX濃度升高，維拉帕米的拮抗效應逐漸減弱甚至消失，具體機制尚待進一步研究。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0215.00±32.71223.33±36.15241.67±77.313

210.00±34.06303.33±45.90△△218.33±45.35(-1.18±11.57)(36.26±9.82)△△(-5.57±17.32)10208.33±21.37373.33±98.52**△△211.67±87.50(-2.14±10.34)(65.99±26.27)△△(-10.54±25.09)30201.67±24.01260.00±97.7898.33±49.56**△(-5.42±9.52)(16.02±35.33)(-58.27±15.47)△△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithmethylenebluePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.亞甲藍預處理標本后，低濃度(-)DOX的正性肌力作用有增強趨勢；但是最高濃度(-)DOX的正性肌力作用受到顯著抑制。該研究結果提示細胞內cGMP可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0221.67±51.54261.43±67.18208.33±64.013

218.33±47.08338.57±96.86△178.33±78.34(-0.93±6.21)(28.96±9.49)△△(-17.71±16.37)10203.33±43.20471.43±107.61**△△153.33±75.28(-7.01±4.22)(81.93±20.75)△△(-30.76±18.38)△30216.67±43.20520.00±103.44**△△73.33±33.27**△△(-0.30±9.38)(101.53±51.95)△△(-64.67±10.74)△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithH-89Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.小結

(-)DOX增強大鼠心房肌收縮力的作用，可能與心肌α受體、M膽堿受體、β受體以及環(huán)氧合酶無關；L型Ca2+通道、細胞內cGMP以及PKA可能在某種程度上參與了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受體、M膽堿受體、β受體、Ca2+通道、環(huán)氧合酶、cGMP及PKA，可能未參與(+)DOX對大鼠左心房的負性肌力作用。第三部分

多沙唑嗪對映體在大鼠、犬和人血漿中的蛋白結合率研究

血漿蛋白結合在藥物治療中起著重要的作用。藥物與血漿蛋白結合的變化顯著影響其藥代動力學和藥效學。對映體蛋白結合的立體選擇性研究是明確其藥理學效應、臨床療效及安全性必不可少的內容。因此，有必要對多沙唑嗪對映體蛋白結合的立體選擇性進行研究。本研究采用平衡透析法利用卵粘蛋白手性色譜柱同時測定大鼠、犬和人血漿中多沙唑嗪對映體的濃度，并計算其蛋白結合率。Agilent1260液相色譜系統(tǒng)（熒光檢測器，四元泵，自動進樣器）色譜柱:UltronES-OVM手性柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm,Shinwa,Japan)流動相:

磷酸鹽緩沖液(20mM,pH5.32)-乙腈(86:14v/v)流速:1.0mL/min柱溫:30°C檢測光譜:激發(fā)波長255nm，發(fā)射波長385nm哌唑嗪,(-)DOX和(+)DOX保留時間分別為6.2min,10.0min及11.3min.色譜條件血漿蛋白濃度分析BCA

蛋白含量檢測試劑盒(MultisciencesBiotechCo.Ltd,Hangzhou,China)分析混和血漿蛋白濃度.試管中加入50ul稀釋血漿(稀釋100倍）及Bradford試劑(1.5mL)，37°C震蕩混勻。

TU-1901UV-VIS紫外分光光度計在562nm處測吸光度。以BSA制作標準曲線測定樣品的蛋白濃度。蛋白結合研究

平衡透析過程依照說明書準備半透膜：煮沸去離子水浸泡20min,30%乙醇浸泡20min.去離子水沖洗,PBS浸泡60min.500ul血漿置于2cm長半透膜透析袋中，兩端結扎，透析袋放入5mL試管（內含200,400or800ng?mL-1(±)DOX的PBS緩沖液3mL）.密閉，37°C溫育15h.HPLC法測定透析袋內及試管內藥物濃度（各取5份樣品）。PBS緩沖液樣品處理

取400μL透析液加入20-μL內標溶液(prazosin1μg?mL-1)加入900μL正己烷－乙酸乙酯(1:1,v/v).渦旋2min,6000rpm離心4min.取上清移入另一試管，氮氣流吹干200μL流動相復溶.取10μL進樣分析，檢測游離藥物濃度透析袋內樣品處理

取100μL透析袋內容加入20μL內標溶液(prazosin2μg?mL-1)及900μL正己烷

－乙酸乙酯渦旋2min,6000rpm離心4min.取上清移入另一試管，氮氣流吹干200μL流動相復溶.取10μL進樣分析，檢測總藥物濃度結

果

采用高效液相色譜法手性分離血漿及PBS中的(±)DOX，專屬性良好，內標（哌唑嗪）、(-)DOX和(+)DOX達到基線分離，最低檢測