免疫金標記技術(研究生講義)

1免疫金標記技術

(Immunogoldlabellingtechique)

2免疫技術試劑標本AgAbAbAg3標記免疫技術試劑標本Ag*AbAb*Ag放射性核素熒光素酶化學發(fā)光劑膠體金標記物技術放射性核素放射免疫技術熒光素熒光免疫技術酶酶免疫技術化學發(fā)光劑化學發(fā)光免疫技術膠體金金免疫技術4金免疫測定技術

金免疫組織化學染色技術

金免疫技術斑點金免疫滲濾試驗金免疫層析試驗金免疫光鏡染色技術金免疫電鏡染色技術5簡介

膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當這些標記物在相應的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現肉眼可見紅色或粉紅色斑點(線);

從而用于抗原或抗體物質的定位或定性。金免疫組織化學染色技術金免疫測定技術67制備膠體金制備免疫金建立金免疫測定技術8

膠體金的特性膠體金（金溶膠）：是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金的特性膠體性質：穩(wěn)定性、對電解質的敏感性光吸收性和呈色性：膠體金的光吸收峰波長隨顆粒的大小而變化。穩(wěn)定性：影響因素---電解質、溶膠濃度、溫度、穩(wěn)定劑9呈色性不同大小的膠體金呈現不同的顏色小顆粒--橙黃色中等顆?！萍t色較大顆?！罴t色大顆粒—紫色10膠體性質穩(wěn)定性：穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮于液體中111％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性λmax

呈色

162.00

橙色518nm24.51.50

橙紅522nm411.00

紅色525nm71.50.70

紫色535nm膠體金粒徑（nm）12膠體金的制備化學還原法:向一定濃度的金溶液內加入一定量的還原劑使金離子變成金原子,形成金顆粒懸液。還原材料：氯金酸（HAuCl4)還原劑：枸櫞酸鹽、白磷、硼氫化鈉、維生素C。。。。最常用的制備方法：枸櫞酸鹽還原法

13

操作要點

配HAuC4水溶液加熱沸枸櫞酸三鈉攪動

加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積

*

見淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過改變枸櫞酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒14制備膠體金的注意事項（1）玻璃容器必須是最好是經硅化處理的。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性（3）氯金酸易潮解（4）制備膠體金應用或者是高質量的去離子水。

，不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。雙蒸/三蒸餾水，絕對清潔的，，應干燥、避光保存。15膠體金的鑒定和保存鑒定

1、清亮透明

2、金顆粒的大小通過觀察膠體金的顏色，粗略估計金顆粒的大小；分光光度計掃描λmax來估計金顆粒的粒徑電鏡觀察保存保存于潔凈的玻璃器皿中，室溫或4°C，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。16優(yōu)質劣質17免疫金的特性

用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質（抗原或抗體）結合，這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物，或簡稱免疫金（immunogold）。膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組織化學技術中，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。物理吸附性：

---

-

++++膠體金蛋白質18免疫金的制備制備要點PH值的調整：原則上可選擇待標記蛋白質等電點，也可略為偏堿蛋白質最適標記量的確定標記過程離心純化：超速離心法免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存：穩(wěn)定劑-PEG，BSA19待標記蛋白作系列稀釋+定量膠體金+Nacl最適標記量：能保持紅色不變而蛋白含量最低的一管蛋白量逐漸減低對照管20金免疫測定技術—

固相膜免疫測定技術固相載體：硝酸纖維素膜標志物：膠體金斑點金免疫滲濾試驗（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA），又稱為滴金免疫測定法金免疫層析試驗

（goldimmunochromatographicassay,GICA）

21斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)

操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底加標本免疫金洗滌液22技術類型：夾心法、間接法

雙抗體夾心法23

間接法

24質控雙抗體夾心法：相應抗原間接法：反應斑點質控點人IgG25反應線質控線陽性陰性26操作技術要點AB27金免疫層析試驗（goldimmunochromatographicassay,

GICA)GTC28

夾心法

競爭法(抑制法）

間接法金免疫層析試驗（goldimmunochromatographicassay,GICA)雙抗原夾心法雙抗體夾心法29雙抗體夾心法G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：特異性抗體

吸水紙標本陽性結果30競爭法標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標準抗原

吸水紙陽性結果31標本G區(qū)：金標特異性抗體(兔型)C區(qū)：羊抗兔IgT區(qū)：標準抗原

吸水紙陰性結果32間接法－反流免疫層析法③⑤合上檢測盒窗(B)吸水材料(A)金標抗人IgG(G0)吸水材料(D)吸水材料(F)標本加樣區(qū)(E)包被抗原（T）①②標記線(G)④⑥⑥液體流動方向包被抗抗體（C）33標本CTCT閉合前閉合后E陽性結果34CT35DIGFA與GICA的比較DIGFA（穿透濾過型）GICA（橫向流動型）硝酸纖維素膜的種類圓片膜窄長型膜試劑形式滲濾裝置及2瓶液體試劑（液相形式）單一試劑條(板)（固相形式）操作步驟31觀察時間操作結束(約3min)即刻觀察操作結束后等待3-20min36IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）37免疫金標記技術的優(yōu)勢

示蹤劑：以膠體金為指示劑，本身形成免疫分析過程后的顏色標記自帶質控對照簡便、快速：全部檢測過程僅需3-20分鐘?？蓡畏輽z測穩(wěn)定性好38

免疫金標記技術的劣勢靈敏度不如酶標技術一般作為定性，不易定量。金標法在臨床中的應用實例1：HBsAg的檢測實例2：HCG的檢測39金免疫組織化學技術一、免疫金（銀）光鏡染色技術二、免疫金電鏡染色技術40

免疫金銀染色原理示意圖

4142HBsAg診斷試劑試劑盒參考圖示43操作步驟1：洗凈雙手

步驟2：用采血針采指尖血

步驟3：將1滴指尖