農(nóng)殘分析6-薄層

薄層色譜法

原理吸附劑展開劑的選配薄層板的制備點(diǎn)樣與展開檢出定性分析定量分析

概念：薄層色譜法又稱薄層層析法.

是利用色譜原理在薄層板上對(duì)混合物中各組分進(jìn)行分離、純化和分析的方法，是把吸附劑或載體均勻地鋪在玻璃板上形成厚度一致的薄層，在其下端點(diǎn)加試樣溶液后，放入底部帶有溶劑(展開劑或移動(dòng)相)的層析缸中，展開劑在薄層板上移動(dòng)至一定高度，使樣本中各組分得到分離。

發(fā)展：屬液相色譜，從柱色譜和紙色譜發(fā)展而來，兼有兩者的特點(diǎn)。

1938年伊馬洛夫用氧化鋁、氧化鎂在薄層板上分離植物成分；1949年梅赫特等首先用黏合劑研制性能穩(wěn)定的薄層；1957年斯塔爾改進(jìn)了儀器，提出了吸附劑規(guī)格和操作方法；20世紀(jì)60年代用于農(nóng)藥分析，1965年薄層色譜。薄層色譜法的特點(diǎn)是：①展開時(shí)間短；一般只需十至幾十分鐘；

②分離能力強(qiáng)，譜帶集中；

③靈敏度高，樣品量很少時(shí)，點(diǎn)樣幾-幾十微克即可以進(jìn)行定性；

④顯色方便；

⑤儀器簡(jiǎn)單，操作方便。

一、原理

按分離機(jī)制可以分為吸附、分配、離子交換及凝膠色譜法等，后兩者在農(nóng)藥分析中極少應(yīng)用。

1．分配色譜原理：（１）正相薄層分配色譜：以纖維素或水、緩沖液、極性有機(jī)溶劑處理過的硅膠為固定相，使用極性較弱的溶劑為流動(dòng)相。（２）反相薄層分配色譜：使用硅酮、石蠟等非極性的溶劑處理過的硅膠或纖維素作固定相，其極性很小，使用極性較強(qiáng)的溶劑作流動(dòng)相。

２．吸附薄層色譜法：

在農(nóng)藥分析中主要使用吸附薄層色譜法（１）原理：由于樣本各組分的理化性質(zhì)不同，它們?cè)谖絼┥系奈阶饔靡膊煌?，各組分隨展開劑由原點(diǎn)向預(yù)定的前沿移動(dòng)時(shí)，在兩相間反復(fù)進(jìn)行吸附和解吸附，吸附強(qiáng)的組分難于被展開劑溶解下來，移動(dòng)速度小，吸附弱的成分較易被展開劑解吸附，移動(dòng)速度較大，移動(dòng)速度的差別，使各成分分離。各組分經(jīng)展開后在薄層板上遷移距離的數(shù)值，可用比移值Rf

來表示。

原點(diǎn)即在薄層板上點(diǎn)加樣本的位置，一般在玻板下端約2cm處。展開劑前沿是指展開劑移動(dòng)的終止位置，同一農(nóng)藥在相同展開劑、吸附劑及相同環(huán)境條件下的比移值是不變的，可以作為農(nóng)藥定性的依據(jù)。

（2）

影響分離效率的因素主要有以下4點(diǎn)：

a.展開劑的選擇和移動(dòng)速度：展開劑在一定的吸附劑上移動(dòng)的速度與其極性和黏度有關(guān)，因此選擇合適的溶劑或混合溶劑作展開劑達(dá)到適宜的展開速度是很重要的。

b.吸附劑的顆粒大?。何絼╊w粒小，分辨率好；但展開速度慢，延長展開時(shí)間會(huì)增加分子橫向擴(kuò)散或拖尾現(xiàn)象，影響分辨效率；為了獲得較好的分離，吸附劑顆粒大小與展開的長度要協(xié)調(diào)好；如果顆粒大展開劑推動(dòng)過速而影響分離效果，則展開距離要延長；市售預(yù)制板顆粒直徑為10~15微米，預(yù)制高效薄層板顆粒直徑5~7微米，自制板所用的吸附劑為30微米或更大些。

c.合適的展開距離:吸附劑顆粒在30微米時(shí)，展開距離以10~15cm為宜；

d.樣點(diǎn)的濃度與大小：點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)使用樣本濃縮液，樣點(diǎn)的直徑盡可能小，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)使用樣本濃縮液，樣點(diǎn)的直徑應(yīng)盡可能小，如點(diǎn)樣成條狀，則其寬度應(yīng)窄，即一邊點(diǎn)樣一邊用吹風(fēng)吹干。點(diǎn)樣距板端2cm，板的點(diǎn)樣一端浸在展開劑中1cm。二、吸附劑吸附劑的基本要求：①表面積大的、內(nèi)部是多孔顆粒狀的固體物。②具有較大的吸附表面和一定的吸附能力，吸附后又很容易用溶劑把樣品成分從表面解吸附下來，即具有可逆的吸附性，使樣品各組分達(dá)到預(yù)期的分離。③與展開劑和樣品中各組分不起化學(xué)反應(yīng)，在展開劑中不溶解。④吸附劑的細(xì)度要求在約30一70μm之間(200一300目)。2.吸附劑的種類

淀粉、菊根扮、滑石、碳酸鈣、碳酸鎂、硅膠、氧化鋁、活性碳、纖維素和聚酰胺等。常用的吸附劑主要是硅膠和氧化鋁。

①

硅膠形成：是由硅酸鈉溶液中加入鹽酸而得的溶膠沉淀，經(jīng)部分脫水而形成的無定形多孔固體，具有微酸性。組成：SiO2.XH2O表示，有多孔的硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，骨架表面有很多硅醇基，能吸附多量水分，此種表面吸附水稱為“自由水”，當(dāng)加熱到120oC左右，能可逆地被除去。交鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部有的水稱為“結(jié)構(gòu)水”，于高溫加熱，將不可逆地失去“結(jié)構(gòu)水”，由硅醇結(jié)構(gòu)(I)變?yōu)楣柩醐h(huán)結(jié)構(gòu)(Ⅱ)?！許i－OH≡Si－O－Si≡硅醇基(Ⅰ)硅氧環(huán)結(jié)構(gòu)(Ⅱ)

影響活性的因素-----

含水量：吸附劑具有不同的吸附能力，稱為活性度，含水量高，吸附力減弱，活性降低；當(dāng)“自由水”含量高達(dá)17％以上時(shí)，吸附能力極低，但可作為分配色譜法的載體。

由于硅膠的吸附力主要與硅醇基數(shù)量有關(guān)，加熱溫度過高，將不可逆地失去“結(jié)構(gòu)水”，硅膠由硅醇結(jié)構(gòu)(I)變?yōu)楣柩醐h(huán)結(jié)構(gòu)(Ⅱ),吸附能力反而降低.

活化：在一定溫度下加熱除去“自由水”，可以使硅膠的活性提高，而加強(qiáng)吸附力，稱為“活化”。

類型：硅膠H——為不加粘合劑的純硅膠；硅膠HF——加有熒光指示劑的硅膠H；硅膠G——硅膠中混有13％左右的石膏粘合劑；硅膠GF——加有熒光指示劑的硅膠G

②氧化鋁氧化鋁有酸性、中性和堿性，在薄層色譜中選用中性氧化鋁，色譜用氧化鋁按含水量多少分為5級(jí)，如下表?；钚约?jí)別

氧化鋁含水量（％）

硅膠含水量（％）

Ⅰ

00Ⅱ

35Ⅲ

615Ⅳ

1025Ⅴ

1538

②氧化鋁

氧化鋁含水量多，活性級(jí)別大，吸附性能小，在一定溫度下加熱除去水分可以使氧化鋁的活性提高而加強(qiáng)吸附力，如在400℃馬福爐內(nèi)，加熱6h，可得活性在I級(jí)的氧化鋁，使用時(shí)加入一定量的水分，可使活性降低，稱為脫活。氧化鋁常用于中性和堿性農(nóng)藥的分離，其作用機(jī)理尚不清，有人認(rèn)為其表面吸附了水形成鋁羧基，亦是以氫鍵作用吸附其它化合物，但當(dāng)氧化鋁高溫加熱至800℃，表面羥基已不存在，吸附活性反而增加，所以推測(cè)它可能是通過A1一O鍵而起吸附作用的。常用的氧化鋁制劑與硅膠相似，有氧化鋁H、氧化鋁HF、氧化鋁G和氧化鋁GF等。

3.吸附劑的細(xì)度

吸附劑顆粒大小對(duì)層析速度、分離效果及Rf值有明顯的影響，顆粒太大，表面積小，吸附量降低，展開速度過快而分離效果不好，顆粒太小則層析速度過慢，易出現(xiàn)拖尾或橫向擴(kuò)散等現(xiàn)象，吸附劑的細(xì)度在30一50μm較好。

三、展開劑的選配

在選擇展開劑時(shí)，應(yīng)從被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的活性和溶劑的極性三方面考慮：（一）、被測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)：

極性大的化合物可以很容易地被吸附劑吸附，需要極性溶劑才能使之解吸附而向前推動(dòng)，弱極性的化合物不易被吸附劑吸附；被測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，其極性也不同?；衔镏懈鞣N官能團(tuán)的極性由小到大次序?yàn)椋和闊N(一CH3，一CH2一)＜烯烴(一CH＝CH一)＜醚類(一OCH3，一OCH2一)＜硝基化合物(一NO2)＜二甲胺一N(CH3)2＜酯類(一COOR)＜酮類()＜醛類(一CHO)＜硫醇(一SH)＜胺類(一NH2)＜酰胺()＜醇類(一OH)＜酚類(Ar一OH)＜羧酸類(一COOH)?；衔镏须p鍵或共軛雙鍵多，則吸附力增大。

（二）、吸附劑的性能：

分離弱極性的化合物，因不易被吸附劑吸附，須選用含水量小、活性大的吸附劑；反之，分離極性強(qiáng)的物質(zhì)，須選用含水量多、活性小的吸附劑。（三）、展開劑的選擇：

一般情況下，農(nóng)藥極性和硅膠都是固定的，要使待分離的物質(zhì)有較適宜的比移值，主要通過選擇合適的展開劑，展開劑的洗脫能力主要由它的極性決定的，極性大的溶劑溶出能力強(qiáng)。

各種溶劑的極性次序如下：石油醚、己烷＜環(huán)己烷＜苯＜甲苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜甲酰胺＜水＜乙酸。展開劑的正確選擇是使農(nóng)藥有效成分與雜質(zhì)分離的關(guān)鍵，可以使用單一溶劑，也可用兩種或兩種以上溶劑。

展開劑不同，分離效果不同

在農(nóng)藥分析中，薄層色譜僅僅是分離手段，要求展開劑不能對(duì)以后的測(cè)定方法產(chǎn)生干擾。

如使用薄層-銀量法測(cè)定農(nóng)藥中所含的氯時(shí)，應(yīng)盡量避免使用三氯甲烷、二氯甲烷等溶劑。

四、薄層板的制備一、玻璃板的規(guī)格：10×15（20）cm,20×15(20)cm,7.5×15(20)cm,5×15(20)cm二、吸附劑勻漿的調(diào)制：吸附劑：溶劑=1：20.5~0.8mm三、涂布：1涂布器的使用；2自制涂布器；3傾倒法。四、風(fēng)干五、活化1硅膠板：105~120°C，

1h;2氧化鋁：80~100oC，

0.5h五、點(diǎn)樣與展開一、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣量：20~40mg；或0.1~1mL；位置：離底端2cm，兩端1~1.5cm；方法：點(diǎn)小，線細(xì)，晾干；二、展開：（色譜過程）

點(diǎn)過樣品的薄層板，經(jīng)紅外，加熱吹風(fēng)等方式將溶劑揮發(fā)盡，放在層析缸內(nèi)進(jìn)行展開，層析缸一般三面襯有濾紙，缸內(nèi)預(yù)先放有展開劑，使蒸汽壓飽和。展開時(shí)，一般使溶劑前沿達(dá)到12~16cm即可，或再高些，根據(jù)實(shí)際情況而定。如果分離效果不理想，也可將薄層板取出晾干后，再換另一種展開劑或原展開劑做同向二次展開。也可用超板展開法，即在溶劑前沿上升到頂端后再展開一段時(shí)間。

溶劑飽和對(duì)展開效果的影響

①第一塊板放人盛有0.5cm二氯甲烷的層析缸中展開，展開時(shí)沒有用缸蓋。

②第二次板放入到內(nèi)有二氯甲烷的玻璃制的層析缸中，加蓋密閉展開，但層析中沒有使用被溶劑飽和的濾紙。

③層析缸內(nèi)壁襯上濾紙。先用展開劑蒸氣飽和后再放人第三塊薄層板，加蓋展開。

六、檢出

分離無色物質(zhì)的混合試樣時(shí)，展開后需要對(duì)待測(cè)成分確認(rèn)和檢出，試樣展開后的圖稱為色譜圖。

常用檢出方法有以下幾種：

1）螢光硅膠板在紫外燈下顯色將薄板放在紫外燈下照射，在紫外光區(qū)有吸收的農(nóng)藥可在白色背景上形成暗紫色譜帶。具有芳香環(huán)、雜環(huán)及共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的組分可以用熒光硅膠板方法顯色，大多數(shù)農(nóng)藥都可用此法。

2）碘顯色將固體碘放在層析缸或干燥器底部，使碘蒸氣揮發(fā)，將簿層板放入碘蒸氣中，有的農(nóng)藥幾秒鐘或數(shù)分鐘即顯出黃色譜帶，多數(shù)農(nóng)藥可以使用此法。

3）氯化鈀顯色