生物化學第二章蛋白質

第二章蛋白質3.1氨基酸的兩性解離性質及等電點3.2氨基酸的化學性質3.3蛋白質的分子結構3.4蛋白質測序的基本方法路線2.1氨基酸的兩性解離性質及等電點氨基酸分子既含有酸性的羧基(-COOH)，又含有堿性的氨基(-NH2)。其-COOH能放出質子(H＋)，而變成-COO－；其-NH2能接受質子，而變成-NH3+。因此，氨基酸是兩性電解質(ampholyte)。+◆通過改變溶液的pH，可使氨基酸分子的解離狀態(tài)發(fā)生改變。

◆氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽離子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離子的形式存在。pH=pI凈電荷=0pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK′1)(pK′2)

當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelctricpoint)。兩個概念兩性離子:同一分子上帶有正負兩種離子等電點:凈電荷為零時的pH值(用pI表示)◆等電點是氨基酸的特征常數(shù)氨基酸的兩性解離符合Bronsted–Lowry的酸堿質子理論，即氨基酸在水溶液中的偶極離子既起酸（質子供體），又起堿（質子受體）的作用。氨基酸完全質子化時，可以看成是多元酸.側鏈不解離的中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和堿性氨基酸可視為三元酸。

在這里同樣可以利用Handerson–Hasselbalch公式進行pH或氨基酸各種離子濃度比例的計算：[質子受體]pH=pK’+lg---------------[質子供體]pK’為表觀解離常數(shù)的負對數(shù)，可用測定滴定曲線的實驗方法求得。其拐點處PH值即為PK’等電點的計算公式:對于一氨基一羧基和一氨基二羧基氨基酸,其公式為:pI=(pK1+Pk2)/2對于二氨基一羧基氨基酸,其公式為:pI=(pK2+pK3)/2等電點的主要用途:1.分離氨基酸(離子交換,電泳等).2.氨基酸制備(等電點沉淀法,電泳等).等電點計算公式的推導：在氨基酸完全質子化時，各種不同氨基酸的等電點可由下面的方法推導出來：對于中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸）：以R表示帶電情況，則：

R+R0+H+

K1’=[R0][H+]/[R+]則[R+]=[R0][H+]/K1’

R0R-+H+

K2’=[R-][H+]/R0則[R-]=[R0]

K2’/[H+]當在等電點時，[R+]=[R-]則有：

[H+]2=K1’·K2’即[H+]=（K1’·K2’）1/2

等式兩邊取負對數(shù)得：

pH=1/2（pK1’+pK2’）也就是pI=1/2（pK1’+pK2’）

K1’

K2’同樣對于三個可解離的氨基酸例如天冬氨酸和賴氨酸來說，只要寫出它的解離公式，然后取兩性離子兩邊的pK值的平均值，則得其等電點。如天冬氨酸的解離如下：

R+R0R-R2-

則pI=1/2（pK1’+pK2’）而賴氨酸的解離如下：R2+R+R0R-

則pI=1/2（pK2’+pK3’）pK1’pK2’pK3’pK1’pK2’pK3’舉例將含有Asp，Gly，Thr，Leu和Lys的pH＝3.0的緩沖溶液，加到預先用同樣緩沖溶液平衡過的Dowex－50陽離子交換樹脂中，然后用該緩沖溶液洗脫，這5中氨基酸洗脫順序如何？并說明原因。

怎么辦Asp>Thr>Gly>Leu>Lys小結1.某氨基酸的等電點即為該氨基酸兩性離子兩邊的pK值和的一半。2.在氨基酸等電點以上任何pH，AA帶凈的負電荷，在電場中向陽極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，AA帶凈的正電荷，在電場中向陰極移動。3.在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷愈多。舉例例1:甘氨酸的pK1=2.34,pK2=9.60.問該氨基酸在pH為5.0時在電場中的移動方向.怎么辦解:先求出甘氨酸的等電點,再根據(jù)等電點與pH的關系,判斷其所帶電荷,從而可得到答案.GlypI=(pK1+Pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97因為等電點(5.97)大于pH(5.0),故而帶正電荷,所以在電場中向負極移動.怎么辦例2:LyspK1=2.18,pK2=8.59,pK3=10.53,問在pH為4.0和在11.5時各帶何種電荷,并說明在電場中的移動方向.解.因Lys屬于堿性氨基酸,所以,它的等電點為:pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56當pH為4.0時,pI大于pH,故是在酸性條件下,氨基酸本身帶正電,在電場中向陰極移動.當pH為11.5時,pI小于pH,故是在堿性條件下,氨基酸本身帶負電,在電場中向陽極移動.怎么辦例3：計算0.1mol/L的谷氨酸溶液在等電點時主要的離子濃度？2.2氨基酸的化學性質2.2.1有氨基參與的反應2.2.1.1與亞硝酸的反應R-CH-COOH+HO-ON→N2+H2O+R-CHCOOH||NH2OH此性質為VanSlyke氨基氮測定方法的原理.2.2.1.2與甲醛的反應：氨基酸是一種兩性電解質，但不能直接用酸或堿來進行定量測定。這是因為氨基酸的酸、堿滴定的等電點pH過高（12-14）或過底（1-2），沒有適當?shù)闹甘緞┛杀贿x用。但如果加入過量的甲醛，生成二羥甲基氨基酸后即可降低氨基的堿性，而增加羧基的酸性，使其PK’值減少2-3個pH單位。這時即可用標準的NaOH溶液滴定。作用:氨基酸的甲醛滴定（formoltitration）法是氨基酸測定的一種常用方法。當氨基酸溶液存在1摩爾/升甲醛時，滴定終點由pH12左右移至9附近，亦即酚酞指示劑的變色區(qū)域，這就是S?rensen甲醛滴定法的基礎。2.2.1.3與?；噭┓磻?/p>

氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時，氨基即被?；?。例如與芐氧（苯甲氧）甲酰氯（carbobenzyloxychlorride）反應：這里-NH2中的一個H被芐氧甲?；珊唽憺镃bz）取代生成Cbz-氨基酸。除了芐氧甲酰氯外，?；噭┻€有叔丁氧甲酰氯，對-甲苯磺酰氯以及鄰苯二甲酸酐等。這些?；噭┰诙嚯牡牡鞍踪|的人工合成中被用作氨基的保護試劑。另一個?；噭┦堑せ酋Ｂ龋╠ansylchloride），它是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯的簡稱，被用于多肽鏈NH2末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。

用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸.DNS+

AA多肽蛋白弱堿DNS-AA多肽蛋白酸DNS-AA+游離AA（乙醚抽提，有熒光）與丹磺酰氯反應2.2.1.4氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應（sanger反應）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱堿中氨基酸作用：多肽及蛋白質的N-末端氨基酸上面的游離氨基也能與2,4-二硝基氟苯作用.所以此反應常用于蛋白質一級結構氨基末端的測定.2.2.1.5氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應

（Edman反應）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA)

（phenylisothiohydantion-AA）弱堿中(400C)(硝基甲烷400C)H+用途：是鑒定多肽N-端氨基酸的重要方法。2.2.1.6烴基化反應2.2.1.7形成西佛堿反應：氨基酸的α-氨基能與醛類化合物反應生成弱堿，即所謂西佛堿（Schiff’sbase）。

R’RR’R||-H2O||C=O+H2N-C-COOH------------→C=N-C-COOH||||HHHH醛氨基酸西佛堿西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應例如轉氨基反應的中間物。2.2.1.8與熒光胺反應：熒光胺可與α-氨基酸中的氨基反應生成產熒光的化合物，且反應非常靈敏。它具有特定的激發(fā)波長（390納米）和發(fā)射波長（475納米），讀取發(fā)射光的熒光強度即可測定氨基酸的含量。2.2.1.9脫氨基反應：見氨基酸代謝。

氨基酸與堿作用生成相應的鹽。氨基酸的堿金屬鹽能溶于水,而重金屬鹽則不溶于水。2.2.2

-羧基參與的反應（1）成鹽反應（2）形成酯的反應用途：是合成氨基酸?；苌锏闹匾虚g體。2.2.2

-羧基參與的反應（3）形成酰鹵的反應用途：這是使氨基酸羧基活化的一個重要反應。2.2.2

-羧基參與的反應（4）疊氮化反應用途：常作為多肽合成活性中間體。2.2.2

-羧基參與的反應（5）脫羧反應用途：酶催化的反應。2.2.2

-羧基參與的反應(1)與茚三酮反應用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。2.2.3-氨基和羧基共同參與的反應茚三酮水合茚三酮（2）成肽反應用途：是多肽和蛋白質生物合成的基本反應。2.2.3-氨基和羧基共同參與的反應(1)巰基（-SH）的性質作用：這些反應可用于巰基的保護。2.2.4側鏈基團的化學性質CH2OCClO作用：與金屬離子的螯合性質可用于體內解毒。(1)巰基（-SH）的性質2.2.4側鏈基團的化學性質作用：氧化還原反應可使蛋白質分子中二硫鍵形成或端裂。胱氨酸(1)巰基（-SH）的性質2.2.4側鏈基團的化學性質作用：可用于比色法定量測定半胱氨酸的含量。硝基苯甲酸二硫化合物(DTNB)(1)巰基（-SH）的性質2.2.4側鏈基團的化學性質作用：可用于修飾蛋白質。二異丙基氟磷酸酯(2)羥基的性質2.2.4側鏈基團的化學性質組氨酸含有咪唑基，它的pK2值為6.0，在生理條件下具有緩沖作用。組氨酸中的咪唑基能夠發(fā)生多種化學反應。可以與ATP發(fā)生磷?；磻?，形成磷酸組氨酸，從而使酶活化。組氨酸的咪唑基也能發(fā)生烷基化反應。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或喪失(3)咪唑基的性質2.2.4側鏈基團的化學性質2.2.5氨基酸的化學合成目前氨基酸的合成方法有5種：（1）直接發(fā)酵法；（2）添加前體發(fā)酵法；（3）酶法；（4）化學合成法；（5）蛋白質水解提取法。通常將直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法統(tǒng)稱為發(fā)酵法。合成方法3.2.6氨基酸的應用1、醫(yī)藥工業(yè)（1）氨基酸輸液必需氨基酸：蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸半必需氨基酸：精氨酸、組氨酸是幼兒所必需的。治療藥劑（1）精氨酸：對治療高氨血癥、肝機能障礙等疾病頗有效果；（2）天冬氨酸：鉀鎂鹽可用于恢復疲勞；治療低鉀癥心臟病、肝病、糖尿病等。（3）半胱氨酸：能促進毛發(fā)的生長，可用于治療禿發(fā)癥；甲酯鹽酸鹽可用于治療支氣管炎等；（4）組氨酸：可擴張血管，降低血壓，用于心絞痛，心功能不全等疾病的治療。2、化學工業(yè)（1）維生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸為原料合成。（2）葉酸：需要用谷氨酸為原料合成。（3）氨基酸表面活性劑：酰基谷氨酸鈉、十六烷基-L-賴氨酰-L-賴氨酸甲酯二鹽酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯鹽酸等具有較強的抗菌殺菌活性，且無刺激性。（4）聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作為合成皮革的表面處理劑；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯與磷酸高級烷基酯結合得到化合物可作為可塑劑，穩(wěn)定劑等。3、食品工業(yè)營養(yǎng)強化劑；谷氨酸鈉－味精；天冬氨酸鈉：可用于清涼飲料，能增加清涼感并使香味濃厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：－甜味素APM4，農業(yè)（1）殺蟲劑：刀豆氨酸、5-羥色氨酸可使南方毛蟲拒食而死；半胱氨酸可殺死黃瓜蠅；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸鹽具有較強的殺蚜蟲和殺螨效果；（2）殺菌劑：N-月桂酰纈氨酸可作為治療稻瘟??；-1，4環(huán)己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；（3）除草劑：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；5、化妝品工業(yè)氨基酸能調節(jié)皮膚pH的變動，對細菌的防護作用，也可作為皮膚、毛發(fā)的營養(yǎng)成分，增加皮膚、毛發(fā)的光澤。防止皮膚干燥的自然保濕因子的主要成分是甘氨酸、羥基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸等游離氨基酸。在化妝品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些維生素，可防止皮膚老化。2.3蛋白質的分子結構蛋白質（protein）：由氨基酸首尾相連而成的共價多肽鏈，是一類高分子化合物；是生物體的主要組成物質之一，是生命活動的基礎，是生命的體現(xiàn)者。蛋白質是具有特定分子結構的高分子化合物。蛋白質的分子結構可人為劃分為一、二、三、四級結構。除一級結構外，蛋白質的二、三、四級結構均屬于空間結構，即構象。構象是由于有機分子中單鍵的旋轉所形成的。蛋白質的構象通常由非共價鍵（次級鍵）來維系。蛋白質結構的主要層次一級結構四級結構二級結構三級結構primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二級結構結構域

supersecondarystructureStructuredoman2.3.1蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構是指蛋白質多肽鏈中通過肽鍵連接起來的氨基酸的排列順序，即多肽鏈的線狀結構。維系蛋白質一級結構的主要化學鍵為肽鍵。胰島素（Insulin）由51個氨基酸殘基組成，分為A、B兩條鏈。A鏈21個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基。A、B兩條鏈之間通過兩個二硫鍵聯(lián)結在一起，A鏈另有一個鏈內二硫鍵。

肽鍵的一些特性：

1）顯示部分雙鍵的性質；

2）不能旋轉;肽單位呈剛性平面結構；

3）呈反式構型;(有Pro參與時例外)。

?它在多肽和蛋白質折疊形成特定的構象過程中起著非常重要的作用。

肽平面（peptideplane）——即酰胺平面（amideplane）由于肽鍵具有部分雙鍵的性質，使參與肽鍵構成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。2.3.2蛋白質的二級結構蛋白質的二級結構是指蛋白質多肽鏈主鏈原子局部的空間結構，但不包括與其他肽段的相互關系及側鏈構象的內容。維系蛋白質二級結構的主要化學鍵是氫鍵。2.3.2.1蛋白質立體結構原則：1.

由于C=O雙鍵中的π電子云與N原子上的未共用電子對發(fā)生“電子共振”，使肽鍵具有部分雙鍵的性質，不能自由旋轉。2.與肽鍵相連的六個原子構成剛性平面結構，即肽單元或肽鍵平面。但由于α-碳原子與其他原子之間均形成單鍵，因此兩相鄰的肽鍵平面可以作相對旋轉。2.3.2.2蛋白質二級結構的類型：蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋，β-折迭，β-轉角及無規(guī)卷曲等幾種類型。1.α-螺旋：α-螺旋是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構象，其結構特征為：⑴為一右手螺旋；⑵螺旋每圈包含3.6個氨基酸殘基，螺距為5.44埃；每個殘基偏轉100°;⑶螺旋以氫鍵維系。一個殘基的>C=O氧與后面第四個(隔3個)殘基的>NH的氫之間形成氫鍵。氫鍵與螺旋軸近乎平行;

影響α-螺旋穩(wěn)定的因素有：⑴極大的側鏈基團（存在空間位阻）如多個側鏈較大的氨基酸(Ile,Trp,Phe等)；⑵連續(xù)存在的側鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基（同種電荷的互斥效應）；⑶有Pro等亞氨基酸存在（不能形成氫鍵,且α-C原子參與吡咯環(huán)的形成,環(huán)內Cα-N和C-N鍵不能旋轉）。2β-折迭：β-折迭是由若干肽段或肽鏈排列起來所形成的扇面狀片層構象，其結構特征為：⑴由若干條肽段或肽鏈平行或反平行排列組成片狀結構；⑵主鏈骨架伸展呈鋸齒狀；⑶借相鄰主鏈之間的氫鍵維系。β-折迭包括平行式和反平行式兩種類型3.β-轉角：β-轉角（U形轉折,發(fā)夾結構）：是多肽鏈180°回折部分所形成的一種二級結構，其結構特征為：⑴主鏈骨架本身以大約180°回折;⑵回折部分通常由四個氨基酸殘基構成;⑶構象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來維系。

(4)主要有兩種類型：I型和II型；二者主要差別是中央肽基旋轉了1800，(5)一些氨基酸如Pro、Gly經常出現(xiàn)在-轉角中；II型-轉角中的第三個氨基酸殘基總是Gly。

3.3.2.5無規(guī)卷曲：無規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無規(guī)律的卷曲構象。約占球蛋白分子結構的一半；蛋白質（酶）的功能部位常常位于這種構象之中。RNase的分子結構α-螺旋β-折迭β-轉角無規(guī)卷曲在蛋白質分子中，若干具有二級結構的肽段在空間上相互接近，形成具有特殊功能的結構區(qū)域，稱模序（motif)或超二級結構。主要有以下三種基本形式：測定蛋白質的一級結構的主要意義：一級結構是研究高級結構的基礎?？梢詮姆肿铀疥U明蛋白質的結構與功能的關系?？梢詾樯镞M化理論提供依據(jù)可以為人工合成蛋白質提供參考順序。3.4蛋白質測序在鐮刀狀紅細胞貧血患者中，由于基因突變導致血紅蛋白β-鏈第六位氨基酸殘基由谷氨酸改變?yōu)槔i氨酸，血紅蛋白的親水性明顯下降，從而發(fā)生聚集，使紅細胞變?yōu)殓牭稜睢?/p>

測多肽鏈數(shù)拆分多肽鏈斷開鏈內二硫鍵氨基酸組成分析鑒定N末端和C末端殘基裂解多肽鏈測各肽段氨基酸序列“片段重疊”法推出一級結構二硫鍵定位基本步驟3.4.1蛋白質測序的基本方法路線

氨基酸順序分析

蛋白質多肽鏈的氨基酸順序分析，即蛋白質一級結構的測定，主要包括以下幾個步驟：1.分離純化蛋白質，得到一定量的蛋白質純品。2.取一定量的樣品進行完全水解，再用氨基酸自動分析儀，測定蛋白質的氨基酸組成?；静襟E：純化蛋白質密封真空管內水解（6NHCl，1100C，24h）離子交換分離得到的氨基酸用茚三酮（ninhydrin）或熒光胺（fluorescamine）等試劑顯色定性和定量（與同樣處理的標準氨基酸比較）。

3.采用特異性的酶（如胰蛋白酶）或化學試劑（如溴化氰）將蛋白質裂解成為長短不一的若干條肽段（必須作兩套）。

BrCN的裂解作用多肽裂解專一試劑：胰蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶溴化氰胰蛋白酶（try