第三章 微生物學(xué)質(zhì)量控制

第三章

實驗動物的微生物學(xué)及寄生蟲控制

實驗動物是指經(jīng)人工培育或人工改造，對其攜帶的微生物和寄生蟲實行控制、遺傳背景明確或來源清楚，并飼養(yǎng)在相應(yīng)的環(huán)境設(shè)施內(nèi)，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生物制品或藥品檢定，以及其他科學(xué)實驗的動物。

實驗動物的質(zhì)量控制包括：微生物、寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制遺傳學(xué)質(zhì)量控制營養(yǎng)學(xué)質(zhì)量控制環(huán)境質(zhì)量控制實驗動物按微生物學(xué)控制的分類

根據(jù)微生物和寄生蟲的凈化程度,GB/T14922.2-2011版國家標(biāo)準(zhǔn)將實驗動物分為四級：一級：普通級動物(Conventionalanimal,CV)二級：清潔動物(Cleananimal,CL)三級：無特定病原體動物

(Specificpathogenfreeanimal,SPF)四級：無菌動物(Germfreeanimal,GF)和悉生動物(Gnotobioticanimal,GN)實驗動物微生物等級GB/T14922.2-2011版國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：小鼠清潔級SPF級無菌級大鼠清潔級SPF級無菌級地鼠普通級清潔級SPF級無菌級豚鼠普通級清潔級SPF級無菌級家兔普通級清潔級SPF級無菌級犬普通級SPF級猴普通級SPF級大、小鼠取消了普通級。第一節(jié)普通級動物

（Conventionalanimal,簡稱CV動物）定義：是指不攜帶國標(biāo)所規(guī)定的人獸共患病病原體和動物烈性傳染病病原體的實驗動物。在我國又被稱為一級動物，是微生物學(xué)控制要求最低的動物。飼養(yǎng)條件：開放環(huán)境來源：經(jīng)微生物學(xué)檢查不帶有上述病原體的動物，或二三級動物放在開放環(huán)境中飼養(yǎng)。優(yōu)點：生產(chǎn)成本低，一般場所即可飼養(yǎng)。普通動物特點：1、微生物學(xué)特點要求最低，不攜帶所規(guī)定的人獸共患病病原和動物烈性傳染病的病原。2、飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)于開放系統(tǒng)。但仍然對溫度（18~29℃）、濕度（40%~70%）、飼料、墊料、飲水、衛(wèi)生等有一定控制。3、生理學(xué)特點外觀健康，飲食排泄正常，無異常分泌物，無臨床癥狀，臟器無眼觀病灶。普通動物的應(yīng)用：多用于生物醫(yī)學(xué)中教學(xué)示教；或作為某些科學(xué)研究為探索方法而從事的預(yù)試驗之用；豚鼠、兔、犬、猴等大動物的實驗研究;不可用于疫苗的生產(chǎn)和檢定。第二節(jié)清潔動物

（Cleananimal，簡稱CL動物）定義：除普通動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學(xué)研究干擾大的病原體。是根據(jù)我國國情而設(shè)定的等級動物。來源：SPF動物、無菌動物、悉生動物或剖腹產(chǎn)動物清潔級動物的特點：清潔級動物比普通級動物要求排除的微生物和寄生蟲多,但比SPF動物少。清潔級動物除肉眼觀察無病外，尸體解剖時，主要臟器、組織無論是肉眼觀看還是病理組織切片均應(yīng)無病變。

清潔級動物的飼養(yǎng)管理

清潔級動物飼養(yǎng)于溫濕度恒定的萬級空氣凈化的屏障系統(tǒng)中。其所用的飼料、墊料、飲用水、籠器具等都經(jīng)過消毒滅菌處理。工作人員需換滅菌工作服、鞋、帽、口罩等進入動物室進行操作。

清潔級動物的應(yīng)用：清潔級動物是根據(jù)我國國情而設(shè)立的等級動物。它較普通級動物健康，又較SPF級動物易達到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在動物實驗中可免受動物疾病的干擾，其敏感性與重復(fù)性亦較好。目前在我國已成為適用于科研的標(biāo)準(zhǔn)級別的實驗動物。第三節(jié)無特定病原體動物

（Specificpathogenfreeanimal，簡稱SPF動物)定義：動物機體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動物。最初來源：來源于無菌動物、悉生動物

SPF動物特點：SPF動物除一、二級動物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對研究實驗干擾大的病原。

SPF動物的飼養(yǎng)管理

必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的萬級空氣凈化的屏障系統(tǒng)中，實行嚴格的微生物控制。飼育設(shè)施有：SPF級動物房、超凈生物層流架、IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)、帶空氣過濾帽的飼養(yǎng)盒。屏障系統(tǒng)內(nèi)（大規(guī)模生產(chǎn)），隔離器內(nèi)保種。

【上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司】【中國科學(xué)院上海實驗動物中心】【國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心】

IVC獨立送風(fēng)系統(tǒng)IVC盒SPF動物的應(yīng)用：

目前國際上公認SPF動物適用于所有科研實驗，是國際標(biāo)準(zhǔn)級別的實驗動物。

1、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究

2、血清、疫苗生產(chǎn)

3、生物學(xué)鑒定工作第四節(jié)

無菌動物（Germfreeanimal

簡稱GF）定義：用現(xiàn)有的檢測技術(shù)在動物體內(nèi)外的任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲的動物。來源：第一代通過無菌剖腹產(chǎn)術(shù)或無菌卵的孵化，以后通過無菌動物雌雄交配繁殖或無菌剖腹產(chǎn)術(shù)，保姆鼠代奶擴群。無菌動物的發(fā)展概況種類培育者及育成時間小鼠Pleasants,1959大鼠Reyniers1946；Gustafsson,1948豚鼠Miyakawa1958;Tanami,1959;兔Wostmann1959;Luckey,1963狗Glimsedt,1946貓Bleby,1969山羊、綿羊Smith,1961,1966豬Whitenair,1960馬Drummond等,1973猴Reyniers,1942雞Reyniers,1943鵪鶉Woodard等,1965;Miles,1966無菌動物特點：1.形態(tài)學(xué)特點：消化系統(tǒng)

(1)盲腸肥大，它的總重量是普通動物的

5-10倍。

(2)腸道肌層薄，腸絨毛變細變短

血液循環(huán)系統(tǒng)

(1)心臟變小

(2)白細胞數(shù)變少，且數(shù)量波動范圍小免疫系統(tǒng)

(1)胸腺、淋巴組織、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育不良

(2)脾臟縮小，無二級濾泡，網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞功能下降。免疫功能基本處于原始狀態(tài)。2.生理學(xué)特點：壽命無菌動物的壽命普遍長于普通動物，如大鼠正常2-3年，無菌達4年。營養(yǎng)和代謝體內(nèi)不能合成維生素B和K，易產(chǎn)生這兩種維生素的缺乏癥無菌動物血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動物長

生長率

不同種屬不一樣．

(1)無菌鳥類生長率高于同種普通鳥

(2)無菌大、小鼠與普通鼠差不多

(3)無菌豚鼠和無菌兔比普通的慢生殖無菌條件對動物的生殖影響不大。

(1)無菌大、小鼠略高于普通大小鼠

(2)豚鼠和兔繁殖能力比普通級低抗輻射能力無菌動物抗輻射能力強，抗實驗性燙傷和抗休克死亡能力也強于普通動物。免疫功能

(1)血清中IgG、IgM水平低，幾乎不存在丙種球蛋白和特異性抗體

(2)免疫應(yīng)答速度慢，過敏反應(yīng)、對異體移植物的排斥反應(yīng)以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱無菌動物在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

1、微生物學(xué)研究

(1)病因?qū)W的研究

(2)微生物間的拮抗作用

(3)病毒性疾病研究

(4)真菌感染研究

２、免疫學(xué)研究

無菌動物體內(nèi)既無抗原也無特異性抗體，處于一種“原始狀態(tài)”，很適合用于各種免疫功能的研究。如，無菌動物暴露于微生物，先產(chǎn)生α球蛋白，再產(chǎn)生β球蛋白，最后產(chǎn)生γ球蛋白。制備高效價，無交叉反應(yīng)的特異性抗體。

３、腫瘤學(xué)研究制備人體腫瘤模型需要免疫抑制動物，而普通動物給予免疫抑制劑后常繼發(fā)感染死亡，所以可以應(yīng)用無菌動物?？梢匝芯看怪眰魅镜闹掳┎≡?，如白血病病毒。研究致癌物質(zhì)的致癌作用和微生物的關(guān)系。４、老年病學(xué)研究無菌動物普遍壽命比普通動物長，說明微生物和機體老化有關(guān)。普通大鼠壽命2年，而無菌大鼠壽命3-4年。５、營養(yǎng)學(xué)的研究無菌動物是研究營養(yǎng)的良好模型，很多營養(yǎng)成分是靠細菌產(chǎn)生的。如VB和VK是靠腸道細菌合成的，無菌動物體內(nèi)不能合成VB和VK，所以可以用來研究哪些細菌合成了哪些維生素。６、放射醫(yī)學(xué)研究無菌動物可以耐受大劑量的放射線照射?？捎脜^(qū)別放射引起的癥狀和繼發(fā)感染的癥狀。７、毒理學(xué)研究藥物的毒理作用常常與腸道細菌的代謝產(chǎn)物有關(guān)。用無菌動物進行研究，可以準(zhǔn)確地分析藥物的毒理作用和藥物的合理使用。８、心血管病研究實驗證實腸道微生物可以分解膽汁酸，降低血液中膽固醇水平。９、宇航中的應(yīng)用可以用來攜帶地外微生物。

因飼養(yǎng)環(huán)境的局限性，無菌動物主要用于某些特殊實驗研究無菌動物的飼料及飼養(yǎng)環(huán)境飼料：60Co照射墊料、飲水及其他用品必須經(jīng)過嚴格的滅菌消毒。注意維生素B、維生素K的補充。飼養(yǎng)條件：必須飼養(yǎng)在與自然界完全隔離的無菌隔離器內(nèi)。無菌動物的檢查第五節(jié)

悉生動物（Gnotobiotic

animal，簡稱GN）定義：又稱已知菌動物，指動物體內(nèi)帶有明確的

微生物種類的動物。飼養(yǎng)條件：無菌隔離器內(nèi)來源：人為將已知的微生物投給無菌動物，使其體內(nèi)帶有已知菌單菌動物雙菌動物多菌動物悉生動物特點：微生物特點：體內(nèi)攜帶有已知微生物來源：無菌動物植入微生物飼養(yǎng)管理：

必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的百級空氣凈化的隔離系統(tǒng)中，實行嚴格的微生物控制。悉生動物腸道內(nèi)存在細菌可以合成維生素，不會像無菌動物一樣發(fā)生維生素缺乏癥。抵抗力、生活力較強，易于飼養(yǎng)管理。悉生動物的應(yīng)用目前廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、代謝性疾病等的病因?qū)W的研究，還有微生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤、骨髓移植等方面。悉生動物的飼養(yǎng)管理必須飼養(yǎng)在溫濕度恒定的百級空氣凈化的隔離系統(tǒng)中，實行嚴格的微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)控制。飼養(yǎng)管理方法與無菌動物相同。第六節(jié)

潔凈動物與普通動物的比較潔凈動物通常是指來源于剖腹產(chǎn)、實行嚴格的微生物控制、飼養(yǎng)于空氣凈化系統(tǒng)設(shè)施內(nèi)的動物，包括清潔動物、SPF動物、悉生動物和無菌動物。潔凈動物與普通動物相比，在很多方面均存在差異。一、微生物控制比較種類飼育環(huán)境說明無菌動物隔離系統(tǒng)無法檢出任何生命體悉生動物隔離系統(tǒng)確知帶有的微生物SPF動物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物清潔動物屏障系統(tǒng)確知不帶有的微生物普通動物開放系統(tǒng)微生物情況不明確二、對科研實驗結(jié)果影響的比較實驗項目GFSPFCLCV傳染病無無無未知寄生蟲無無無未知試驗結(jié)果明確明確明確有疑問用動物數(shù)少少較少多或大量統(tǒng)計價值很好可能好較好不準(zhǔn)確長期實驗

好好可能好困難死亡率很少少較少高長期實驗成活率100%90%80%40%實驗標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計可能可能可能不可能結(jié)果討論價值很高高較高有疑問因此，使用無菌動物、悉生動物、SPF動物和清潔級動物做實驗，由于它們有明確的微生物背景和可控的飼育環(huán)境，可大大提高動物實驗的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。三、生物學(xué)特性的比較潔凈動物與普通動物相比，在血液學(xué)、血液生化指標(biāo)及主要臟器系數(shù)方面均產(chǎn)生一定變化。如清潔級大鼠與普通大鼠相比，白細胞較少，其中中性粒細胞少，淋巴細胞相對增加；血清堿性磷酸酶、膽紅素、膽固醇值較高;尿素氮、肌酐值比較低；空腸淋巴結(jié)、脾臟較輕；肺、腎組織形態(tài)比普通大鼠健康。四、潔凈動物的培育一、無菌動物的培育無菌動物的理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)：胎盤屏障和屏障觀念。1、無菌手術(shù)小哺乳動物動物：子宮切除術(shù)（剖腹產(chǎn)）大哺乳動物動物：子宮切開術(shù)（剖腹產(chǎn)）鳥類：消毒卵2、哺乳人