生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保存

第四章生產(chǎn)菌種的制備和保藏生產(chǎn)菌種的制備過程生產(chǎn)菌種的保藏生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制

第一節(jié)生產(chǎn)菌種的制備過程菌種→母斜面→子斜面→搖瓶菌絲→種子罐→發(fā)酵罐

實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體

活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長

無雜菌污染一、孢子的制備放線菌孢子的制備：營養(yǎng)要求：營養(yǎng)物質(zhì)含量要低，特別是氮源培養(yǎng)基：瓊脂斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度：28~37℃

培養(yǎng)時間：5~14天斜面含水量：低

棒狀鏈霉菌成熟單菌落生長豐滿，緊密，菌落呈草帽形，中間突起，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子為暗灰綠色，成熟后，孢子易于刮下棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株單菌落形態(tài)特征

棒狀鏈霉菌斜面一般培養(yǎng)四到五天左右產(chǎn)生孢子，六到七天斜面孢子生長成熟，氣生菌絲顏色為白色，基內(nèi)菌絲由淺黃到灰黃，都不產(chǎn)生可溶性色素，孢子呈暗灰綠色棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株的斜面培養(yǎng)特征

霉菌孢子的制備：營養(yǎng)要求：碳、氮含量要低，無機鹽適量培養(yǎng)基：天然農(nóng)產(chǎn)品培養(yǎng)溫度：25~28℃

培養(yǎng)時間：4~14天

細菌種子的制備：營養(yǎng)要求：營養(yǎng)豐富，氮源含量要高培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)溫度：37℃

培養(yǎng)時間：1~2天（芽孢5~8天）二、搖瓶種子的制備一級搖瓶→二級搖瓶→種子罐三、種子罐種子的制備一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐（三級發(fā)酵）級數(shù)的確定：菌種的特性；發(fā)酵罐的體積谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)

級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個方面四、種子制備過程舉例1、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時

生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），

32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列pH7.0-7.2時結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛2、青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點小）有利于孢子的生長。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強第二節(jié)生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制一、影響孢子質(zhì)量的因素1.培養(yǎng)基營養(yǎng)成分滅菌的質(zhì)量斜面培養(yǎng)基的含水量2.培養(yǎng)溫度和濕度的影響菌體生長溫度范圍寬些28~37℃

，孢子形成溫度窄27、28℃3.培養(yǎng)時間過短：孢子不成熟；低溫保藏時、易死亡過長：菌體代謝活力降低，產(chǎn)量低4.保藏時間一般不超過一星期5.接種量在母斜面上形成單菌落，在子斜面上形成一層菌落二、影響種子質(zhì)量的因素及控制措施1.影響因素：①培養(yǎng)基②培養(yǎng)條件③培養(yǎng)時間最適種齡：對數(shù)生長期后期

種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。菌齡過?。貉舆t期長，菌體生長緩慢，生物合成期縮短，產(chǎn)量降低種齡長：易老化④接種量

接入種子液的體積接入后培養(yǎng)液體積接種量范圍：1~25%，但是一般認為大一點好過大：菌體過度生長，營養(yǎng)物質(zhì)及溶氧不能滿足菌體需要，使菌體衰老、自溶過?。荷a(chǎn)期延長，以產(chǎn)生菌絲結(jié)團，產(chǎn)量降低接種量=×100%雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。2.種子質(zhì)量的控制指標(biāo)菌體的形態(tài)碳、氮、磷的代謝情況菌株的生產(chǎn)能力特殊酶活力3.種子異常分析菌絲生長過慢：培養(yǎng)基質(zhì)量不好；滅菌質(zhì)量

不好；通入空氣的溫度過低菌絲結(jié)團：接種量?。慌囵B(yǎng)基粘度不當(dāng)；攪

拌不好菌絲粘壁：攪拌不好；裝料系數(shù)少；泡沫多第三節(jié)生產(chǎn)菌種的保藏一、微生物菌種的保藏要求要求：①是廣泛收集各種研究、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，滿足各方面需求；②高質(zhì)量保藏，即要求保藏的菌種不死亡、活性不衰老、特性不變異、分類不紊亂；③隨時可提供保持有原始特性的菌種用于交換和使用。二、菌種保藏原理原理：將微生物菌種保存在不利于微生物活躍生長和代謝的不良環(huán)境中，如干燥、低溫、缺氧、黑暗、營養(yǎng)饑餓等等，使微生物代謝速率極為緩慢或處于休眠狀態(tài)。而一旦恢復(fù)所保存菌種生長的正常環(huán)境和營養(yǎng)條件，即可獲得具有高生理活性和保持原種優(yōu)良性狀的菌種培養(yǎng)物。三、微生物菌種保藏的常用方法菌種保藏的方法有多種多樣，常用方法簡介如下：

1、斜面低溫保藏法

2、

液體石蠟封藏法

3、

沙土管保藏法

4、甘油低溫保存法

5、真空冷凍干燥保藏法

6、液氮超低溫保藏法

1、斜面低溫保藏法

4℃保存，1~3月2、

液體石蠟封藏法石蠟→滅菌→冷卻→加入試管中

3、

沙土管保藏法

1mol/L酸洗→1mol/L堿洗→蒸餾水洗→烘干→過篩→混合（3：2或1：1）→分裝沙土管→

干接法：接孢子后，低溫抽真空濕接法：接孢子懸液后，低溫抽真空取沙取土（沙:20~40目）（土:40~60目）4、

甘油低溫保藏法

等體積混合→-20℃以下保存孢子懸液或菌體30~40%甘油

如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有應(yīng)用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。5、真空冷凍干燥保藏法

等體積混合→分裝凍干管→冷凍至15℃以下→抽真空→封口→低溫保存脫脂牛奶孢子懸液（洗凈）凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿．(3)在安瓿中加入0.5～1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。6、液氮超低溫保藏法

10%甘油懸液→降溫至0℃→緩慢降溫至-35℃→放入液氮缸中→

液相：-196℃

（氣相：-150℃

）孢子懸液、(一)冷凍保護劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟1．待冷凍保藏菌種懸液的制備(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5～1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間達到平衡。

2．控速冷凍(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結(jié)點(通常為-30℃)；(4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變；(5)細胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解凍；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2ml無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。常用菌種保藏方法的比較方法原理適宜菌種保藏時間特點冰箱低溫（4℃）低溫各大類微生物3-6個月簡便石蠟油封藏低溫、缺氧各大類微生物1-2年簡便砂土保藏干燥、無營養(yǎng)產(chǎn)芽孢細菌、產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌1-10年簡便有效冷凍干燥保藏干燥、低溫、無氧各大類微生物5-15年以上繁而高效基因工程菌的保藏