蛋白的分離和純化

關(guān)于蛋白的分離和純化第一頁，共十七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的意義蛋白質(zhì)是各種生物有機(jī)體的重要組成部分。是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。機(jī)體的很多活性物質(zhì)如酶、多肽激素、抗體、核蛋白都是蛋白質(zhì)，它們參與重要的生命活動。蛋白質(zhì)也就成為揭示生命活動現(xiàn)象和分子生物學(xué)機(jī)理的重要研究對象。研究蛋白質(zhì)首要步驟就是將目的蛋白從復(fù)雜的大分子混合物中分離純化出來，得到高純度的有生物活性的目的蛋白。因此高效的分離純化技術(shù)是蛋白質(zhì)研究的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一。第二頁，共十七頁，2022年，8月28日

蛋白質(zhì)的提取1.材料的選擇原則含較高質(zhì)量的所需蛋白來源方便2.組織細(xì)胞的破碎

高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。第三頁，共十七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的提取3.提取根據(jù)其性質(zhì)選用適當(dāng)?shù)娜苊胶吞崛〈螖?shù)以提高收率防止細(xì)胞內(nèi)外蛋白酶對有效成分的水解

應(yīng)對方法：加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以一直或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以一直那些活性中心需要有巰基的蛋白水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清楚蛋白水解酶的活性其他因素對蛋白質(zhì)構(gòu)象的破壞作用例如溫度、PH、離子強(qiáng)度等第四頁，共十七頁，2022年，8月28日蛋白的分離純化方法一根據(jù)溶解度不同二根據(jù)分子大小不同三根據(jù)電離性質(zhì)不同四根據(jù)配基特異性不同第五頁，共十七頁，2022年，8月28日一根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1.等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。2.鹽析沉淀——常用的蛋白質(zhì)沉淀方法一定濃度的鹽溶液（例如硫酸銨、氯化鈉）可中和蛋白質(zhì)的電荷以及水化膜受到破壞，影響了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性使蛋白沉淀3低溫有機(jī)溶劑沉淀法——常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水低。在一定量的有機(jī)溶劑中，蛋白質(zhì)分子間靜電引力增加，水化作用降低，促使蛋白質(zhì)聚集沉淀有機(jī)溶劑多為丙酮、乙醇注意：對于蛋白質(zhì)的沉淀一般要求低溫條件下進(jìn)行第六頁，共十七頁，2022年，8月28日二根據(jù)分子大小不同的分離純化方法1.透析和超濾透析是利用蛋白質(zhì)分子對半透膜的不可透過性而將不同蛋白質(zhì)分開此法簡單，常用于蛋白質(zhì)的脫鹽，但耗時(shí)長超濾是利用超濾膜在外力作用下，大分子物質(zhì)被截留而小分子濾過排出。該方法是根據(jù)分子大小和形狀，在10-8cm數(shù)量級進(jìn)行選擇性分離。常用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、脫鹽、分級純化第七頁，共十七頁，2022年，8月28日二根據(jù)分子大小不同的分離純化方法2.分子排阻層析（分子篩層析、凝膠過濾）其原理是利用不同分子量的蛋白通過具有分子篩性質(zhì)的凝膠而被分離。分離次序：在層析洗脫時(shí)，大分子受阻小而最先流出，小分子受阻大而最后流出。常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠。第八頁，共十七頁，2022年，8月28日二根據(jù)分子大小不同的分離純化方法3.密度梯度離心蛋白質(zhì)的沉降速度取決于分子大小和密度。當(dāng)其在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的沉降得快。而且當(dāng)?shù)鞍壮两档脚c自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，就停止不前，可分步收集進(jìn)行分析。該法在離心中使用密度梯度具有穩(wěn)定作用，可以抵抗由于溫度變化或機(jī)械振動引起區(qū)帶界面的破壞而影響分離效果第九頁，共十七頁，2022年，8月28日三根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法1.電泳法帶電介質(zhì)在電場中向電荷相反的方向移動。這種性質(zhì)叫電泳。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同PH條件下，所帶的電荷質(zhì)和量各異。蛋白質(zhì)移動的方向和速度主要取決于蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)、數(shù)量、質(zhì)點(diǎn)的大小及形狀。第十頁，共十七頁，2022年，8月28日三根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法1.電泳法第十一頁，共十七頁，2022年，8月28日三根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法2.離子交換層析原理：第十二頁，共十七頁，2022年，8月28日三根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法2.離子交換層析離子交換纖維素離子交換凝膠大孔型離子交換樹脂普通離子交換樹脂適用于小分子離子化合物的分離（例如氨基酸、多肽）適用于大分子物質(zhì)的分離和純化第十三頁，共十七頁，2022年，8月28日四根據(jù)配基特異性不同的分離純化方法親和層析法（又叫選擇層析、功能層析、生物特異吸附層析）親和力：蛋白質(zhì)與其相對應(yīng)的化合物（稱為配基）所具有特異結(jié)合的能力。該方法的重要特性：高度特異性如抗體和抗原、酶與底物或抑制劑、RNA與互補(bǔ)的DNA之間都有高度的選擇性可逆性例如抗原和抗體的反應(yīng)，一般堿性時(shí)結(jié)合，酸性時(shí)解離。是一種具有高度專一性分離純化蛋白質(zhì)的有效方法第十四頁，共十七頁，2022年，8月28日總結(jié)蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)策略針對我們的研究目的不同，合理選擇蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)、方法。一種方法往往不能夠很好地獲得目的蛋白質(zhì)，常常結(jié)合兩種分離方法，更能夠獲