蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

關(guān)于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日一、化學(xué)修飾的原理概念：從廣義上說，凡是通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。有的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(稱非必需部分的修飾);但大多情況下將導(dǎo)致生物活性的改變(如下降以至完全喪失)。影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素：1.蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性；2.修飾劑的反應(yīng)性。第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾主要是通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。其重要作用是用于探測活性部位的結(jié)構(gòu)。理想情況下,修飾試劑只是選擇性地與某一特定的殘基反應(yīng),很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。在20種常見AA殘基中，僅具極性的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾，這些基團(tuán)的反應(yīng)性取決于其親核性。第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.1特定的AA殘基側(cè)鏈

基團(tuán)的反應(yīng)試劑（4種）2.1.1?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)

這類化學(xué)修飾試劑如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基異脲等，在室溫(20oC~25oC)，pH4.5~9.0的條件下可與蛋白質(zhì)某些側(cè)鏈基團(tuán)如-NH2、-OH、-SH及酚基等發(fā)生?；磻?yīng)。第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.1.2烷基化反應(yīng)

此類試劑(如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰鹵代物、碘甲烷等)常帶有活潑的鹵素原子，因其電負(fù)性而使烷基帶部分正電荷，易于導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基團(tuán)(如-NH2、-SH、-COOH、-SCH3和咪唑基

)發(fā)生烷基化。第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.1.3氧化和還原反應(yīng)H2O2、N-溴代琥珀酰亞胺等具有很強(qiáng)氧化性，能將側(cè)鏈基團(tuán)(-SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧化,往往易使肽鏈斷裂(故要控制好氧化條件);光敏劑存在下的光氧化是比較溫和的氧化作用。2-巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的還原劑。連四硫酸鈉或鉀是一溫和的氧化劑，常用于-SH的可逆保護(hù)劑。第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.1.4芳香環(huán)取代反應(yīng)蛋白質(zhì)AA殘基的酚羥基在3和5位上易于發(fā)生親電取代的碘化和硝化反應(yīng)。這類修飾反應(yīng)的典型例子為四硝基甲烷(TNM),

可以作用于Tyr的酚羥基,形成3-硝基Tyr衍生物。這種產(chǎn)物有特殊光譜，可用于直接的定量測定。第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.2巰基的化學(xué)修飾巰基具有很強(qiáng)的親核性，是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。常用的修飾劑有3種：1.烷基化試劑特別是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修飾劑。修飾產(chǎn)物相當(dāng)穩(wěn)定，易于分析。此類試劑還能與Met\Lys\His反應(yīng)。第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.有機(jī)汞試劑是最早使用的-SH修飾劑之一，其中最常用的是對氯汞苯甲酸，它與-SH形成的衍生物在250nm處有最大吸收，可容許低濃度蛋白質(zhì)的光譜定量分析。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)與蛋白質(zhì)分子中側(cè)鏈-SH反應(yīng)很快,并在395nm處產(chǎn)生1個(gè)負(fù)差吸收峰.3.-SH的氧化也是一種專一性很高的化學(xué)修飾手段.H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在較大量時(shí)形成磺酸，也可以生成次磺酸。第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.3氨基的化學(xué)修飾氨基的修飾可分為三類：引入正電荷的修飾；電荷消失的修飾；引入負(fù)電荷的修飾。第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.3.1引入正電荷的修飾Lys--NH2以非質(zhì)子化形式存在時(shí)很活潑,是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)，可被選擇性修飾。Lys修飾后側(cè)鏈留下可電離的帶正電的基團(tuán)。還原烷基化：醛與Lys側(cè)鏈反應(yīng)形成希夫堿，再用硼氫化鈉（NaBH4）還原希夫堿，得到穩(wěn)定衍生物。

P-NH2+RCHOP-N=CHRP-NH-CH2R-H2O+H2O[H]第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.3.2電荷消失的修飾這類試劑可抑制Lys--NH2的質(zhì)子化,使形成的衍生物不帶電。1.乙酰化：在微堿性pH下，氨基與乙酸酐反應(yīng)生成乙酰化衍生物。2.芳香化：三硝基苯磺酸與氨基作用,生成的衍生物為黃色，可定量測定-NH2。

(其它:DNFB\DNS)三硝基苯磺酸(TNBS)第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.3.3引入負(fù)電荷的修飾1.乙?；?

此反應(yīng)類似于乙酸酐與氨基反應(yīng),但酸酐(如琥珀酸酐)所帶負(fù)電荷全部引入到側(cè)鏈上。2.烷基化：第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.4羧基的化學(xué)修飾由于羧基在水溶液中的化學(xué)性質(zhì),使得蛋白質(zhì)分子中Glu和Asp的修飾很有限,產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類.目前最常用的標(biāo)準(zhǔn)方法,在比較溫和的條件下就可進(jìn)行胃蛋白酶與[14C]硼氟化三甲洋鹽在pH5時(shí)酶完全失活,研究表明兩-COOH為該酶必需基團(tuán)第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.5咪唑基的化學(xué)修飾His殘基的咪唑基可通過N原子的烷基化或C原子的親核取代來進(jìn)行修飾。焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的His殘基的修飾試劑,在近中性時(shí)專一性較好,使His殘基的咪唑基上1個(gè)N羧乙基化,并使得在240nm處的光吸收增加。在堿性條件下該取代反應(yīng)是可逆的。第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1特定的AA殘基側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)試劑

（4種方法）

2.2巰基的化學(xué)修飾2.3氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4羧基的化學(xué)修飾2.5咪唑基的化學(xué)修飾2.6二硫鍵的化學(xué)修飾第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.6二硫鍵的化學(xué)修飾同-SH類似,-S-S-具有其特有的特性,可用來進(jìn)行特異的修飾,通常是通過還原的方法.這些方法通常與某些-SH修飾方法結(jié)合,以阻止再氧化成-S-S-或計(jì)算斷裂開的-S-S-數(shù)目。常用的有:巰基乙醇(具高度選擇性和長的半衰期.但要有變性劑,且使用大大過量的巰基乙醇)、Cleland試劑包括二硫蘇糖醇(DTT)及其差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇(DTE)(勿需過量還原劑)。-S-S-經(jīng)還原成為-SH，一般情況下很容易自動(dòng)氧化，故需經(jīng)過羧甲基處理防止重新氧化。第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)雙功能試劑：指具有兩個(gè)反應(yīng)活性部位，可在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內(nèi)、鏈間或蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變的試劑。雙功能試劑還可將一蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到一個(gè)化學(xué)惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白質(zhì)。表征交聯(lián)在一起的氨基酸殘基或蛋白質(zhì),可提供許多關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)間相互作用的信息。第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日交聯(lián)劑的應(yīng)用研究蛋白質(zhì)的折疊:

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度很大時(shí),交聯(lián)劑也能形成分子間的交聯(lián)鍵,使蛋白質(zhì)對變性趨于穩(wěn)定。

如Rajput等用戊二醛將胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交聯(lián)在一起。這種固定化的雜化酶的優(yōu)點(diǎn)是，顯著地降低了雜化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同時(shí)也使反應(yīng)器的體積大大縮小。酶分子內(nèi)的交聯(lián)常可提高酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性，防止酶失活。因此，設(shè)法增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目是酶固定化的方法之一。第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日3.3交聯(lián)劑的應(yīng)用測定蛋白質(zhì)亞基的量:

如用辛二亞氨酸二甲酯作用于齊聚體蛋白質(zhì),使在同一亞基內(nèi)和多亞基間的Lys殘基之間形成交聯(lián),再進(jìn)行SDS,則可測定其分子量和亞基的數(shù)目,以闡明亞基的組合情況(如單體、二聚體還是三聚體等）。用交聯(lián)劑還能測定蛋白質(zhì)上殘基間的距離。如用跨度為0.37~1.45nm的一系列亞氨酯交聯(lián)糖原磷酸化酶b,再結(jié)合SDS系統(tǒng)測定出,在有效交聯(lián)形成的四聚體上的兩Lys殘基間距離約為0.8nm。第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日五、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用5.1用于測定蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸的數(shù)量研究蛋白質(zhì)性質(zhì)時(shí)，常需測定其中含有某種AA的數(shù)量。當(dāng)然用AA分析法可得到此數(shù)據(jù)。但當(dāng)只需知道某一AA的數(shù)量,不需知道其它AA數(shù)量時(shí),則應(yīng)建立僅對某一氨基酸的快速靈敏的分析方法,實(shí)際上是用于蛋白質(zhì)定量化學(xué)修飾。常用且靈敏度高的方法是對氯汞苯甲酸與-SH作用;三硝基苯磺酸與-NH2作用。用熒光法可測定微量蛋白質(zhì),

靈敏度高，常用熒光胺。第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日5.2在蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用用于測定蛋白質(zhì)及多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)的許多方法都是以蛋白質(zhì)化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的。A.控制酶解程度:如常用胰蛋白酶專一水解堿性氨基酸(Arg和Lys)的-COOH所形成的肽鍵。若要使胰蛋白酶只水解Arg所形成的肽鍵,可用三氟乙?；▽ys--NH2保護(hù)起來,使它轉(zhuǎn)變?yōu)槊覆荒芩獾漠a(chǎn)物。B.化學(xué)裂解:最理想且普遍采用的是CNBr專一性裂解Met的-COOH所形成的肽鍵。第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日5.3確定蛋白質(zhì)殘基的功能化學(xué)修飾結(jié)合保護(hù)實(shí)驗(yàn)可研究底物或其它配位體對修飾速度和程度影響。如用磷酸吡哆醛修飾Fru-6-P激酶時(shí),發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)Lys被修飾,酶活力喪失;而在Fru-2,6-PP存在時(shí),則可減弱修飾作用,保護(hù)激酶活力。若修飾的可逆性與生物功能的改變有對應(yīng)關(guān)系,也可為確定某一殘基的可能功能提供有利證據(jù);用于蛋白質(zhì)變構(gòu)部位上必需AA殘基的