體內(nèi)藥物分析

綴合物：綴合物類型：①葡萄糖醛酸苷：含-OH、-COOH、-NH2、-H等功能團(tuán)的成分可與葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物②硫酸酯：芳胺、酚類及醇類成分可與硫酸形成硫酸酯綴合物血漿蛋白結(jié)合率：反映了藥物與血漿蛋白的親和程度。一般指在治療量時(shí)藥物結(jié)合的百分率，作為藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一，影響了藥物在體內(nèi)的分布、代謝、排泄，與藥物的藥理作用強(qiáng)度密切相關(guān)。一相代謝：氧化、還原、水解反應(yīng)。在藥物結(jié)構(gòu)中引入羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)，為二相代謝做準(zhǔn)備二相代謝：結(jié)合反應(yīng)。具有羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)的藥物與糖、硫酸鹽、氨基酸等結(jié)合，極性增大，利于排肝內(nèi)代謝反應(yīng)類型：以氧化為主，其次為還原、水解結(jié)合腸內(nèi)菌的生物轉(zhuǎn)化：利用腸內(nèi)菌微生物中特定酶將中藥成分（或天然化合物）進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，屬單酶或雙酶的高密度轉(zhuǎn)化。具有高度選擇性（尤其是立體選擇性）和反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)。以水解反應(yīng)為主，其次為氧化還原反應(yīng)。?蛋白質(zhì)的去除：沉淀法（有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法、酸性試劑沉淀法、加熱沉淀法）；酶消化法；超濾法、透析法、微孔濾膜過濾法。?影響液相提取的因素：提取溶劑；水相PH值（根據(jù)待測成分PKa；為保證提取率的重現(xiàn)性，常使用緩沖溶液）；離子強(qiáng)度（越大提取率越高）?影響固相提取的因素：合適的洗滌劑和洗脫劑；流速（不宜過快）；上樣量（樣品突破性實(shí)驗(yàn)可判斷上樣量是否超載）?固相提取的操作步驟：固相柱選擇、處理一樣品上樣一分離純化一洗脫待測成分一濃縮處理或直接進(jìn)樣分析?檢測限和定量限LOD&LOQ的確定和要求：LOQ【能從背景信號中區(qū)分出藥物時(shí)所需樣品中藥物的最低濃度】可于空白生物基質(zhì)加入定量的藥物標(biāo)準(zhǔn)品混勻，配制成藥濃在標(biāo)準(zhǔn)曲線末端并逐漸降低的一組藥品，然后對每種濃度測定3?5次，以測定結(jié)果的精密度達(dá)到W20%和準(zhǔn)確度達(dá)到W+20%時(shí)的樣品中藥物的最低濃度。LOD【保證具有一定可靠性前提下，分析方法能測定出樣品中藥物最低濃度】-測定時(shí)記錄各濃度樣品每次測定得到的藥物信號強(qiáng)度S與噪音/背景信號強(qiáng)度N,然后取均值S、N,以能達(dá)到S/N=3時(shí)樣品藥濃為LOD。?提取回收率的操作與要求：往空白生物基質(zhì)或含藥物的樣品中加入的藥物標(biāo)準(zhǔn)品已知量A,實(shí)際上是準(zhǔn)確加入已知濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液一定體積，使兩種考核樣品內(nèi)含總藥濃應(yīng)包括高、中、低三種（濃度接近最高、平均、最低藥濃）。每個(gè)濃度應(yīng)測定多次（3?5），并且?guī)状螠y定值M的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)符合“內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物回收率與待測物不相差10%”的要求，然后取均值M?透析法影響因素：透析膜對藥物的吸附；donnan效應(yīng)；緩沖液體積變化。分析常用生物樣品的種類和特點(diǎn)a?血樣①常用于藥代動(dòng)力學(xué)、生物利用度、血藥濃度檢測②包括全血、血漿和血清，其中血漿和血清常用③全血加抗凝劑，離心后分取上清液得到血漿④全血在纖維蛋白原等作用下引起血塊凝結(jié)析出，離心后取上清液得到血清⑤常用抗凝劑有肝素、鈣結(jié)合劑EDTA、枸緣酸鈉、草酸鉀、氟化鈉等。常用肝素⑥制備血清時(shí)血塊凝結(jié)，易造成成分吸附損失⑦抗凝劑的選擇可影響測定結(jié)果b?尿液①常用于成分代謝研究②尿液樣品量大，待測成分濃度高、變化較大、與血液的成分濃度相關(guān)性不強(qiáng)⑤短時(shí)間內(nèi)不可能多次取樣，不易采集完全c?唾液①可用于藥代動(dòng)力學(xué)和藥物濃度監(jiān)測②唾液中成分濃度通常與血漿濃度相關(guān)。一般低于血漿濃度且變化較大，但二者存在恒定的比例關(guān)系③采集不受地點(diǎn)、時(shí)間限制，易獲得④許多用于血漿測定的方法稍加改進(jìn)即可用于唾液測定⑥組成受各種因素影響較大，且個(gè)體差異較大d?臟器①用于研究成分在各器官、組織的分布、積蓄或代謝情況②臟器組織可與成分形成強(qiáng)烈結(jié)合③在分離分析前，需預(yù)先制成1:5或1:10的勻漿，以提高溶劑抽提率，降低組織空白值，避免乳化2?體內(nèi)分析常用生物樣品的采集和貯存方法；采集：必須有代表性，應(yīng)力求取樣條件標(biāo)準(zhǔn)化，包括攝取標(biāo)準(zhǔn)膳食，控制飲水量等。保存：①血漿、血清：盡快從全血中分離，一般不超過24小時(shí)，冷凍貯存②尿液：采樣后立即加入防腐劑（甲苯、氯仿）室溫保存或冷凍貯存③臟器組織：-20°C冷凍3?生物樣品的常用保存方法：冷凍貯存①短時(shí)間內(nèi)分析的樣品，4C冷藏②放置數(shù)日或更長時(shí)間的樣品-20C③冷凍樣品測定時(shí)，須臨用前解凍，并在解凍后一次性測定完畢，不宜反復(fù)冷凍解凍，否則會(huì)導(dǎo)致成分含量下降；B.加穩(wěn)定劑①加入酶活性阻斷劑：氟化鈉（常用，可抑制血清酯酶，并抗凝防腐）四氫尿苷、三氯酸鈉②加抗氧劑VC；C.加防腐劑：尿液中加甲苯（每100ml尿液加1ml充分振蕩混勻或加在尿液表面形成薄層）、氯仿（加少許搖勻使其飽和，瓶底留少量氯仿）等；D.調(diào)pH值：加無機(jī)酸或碳酸鈉改變尿液酸堿度，可抑制細(xì)菌生長5?體內(nèi)分析方法設(shè)計(jì)思路和建立步驟、評價(jià)指標(biāo)和方法。研究思路：①樣品：中藥水煎劑②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：犬豬③給藥途徑：口服④含藥血清：不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清（時(shí)效曲線）血清藥理學(xué)研究（藥效機(jī)理）⑤相關(guān)分析：體內(nèi)直接物質(zhì)接觸，原型成分，代謝產(chǎn)物藥物分析方法評價(jià)指標(biāo)：準(zhǔn)確度、精密度、檢測限和定量限、專屬性、藥物穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、耐用性、樣品測定（QC樣品）1?準(zhǔn)確度：A.回收率⑴提?。ㄝ腿?絕對）回收率測定方法①對比法②標(biāo)準(zhǔn)曲線法；⑵相對回收率：回收試驗(yàn)法、加樣回收試驗(yàn)法。2?精密度：（測定結(jié)果與平均值的偏離程度）將分析后剩余樣品混合成含藥濃高中低三種，測定時(shí)對每種重復(fù)測定3-5次，并且每次應(yīng)從取樣開始至測定完成后得到的結(jié)果。將得到的測定值分別算出高中低三種藥濃樣品測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD。3?靈敏度：【LOD+LOQ】光譜分析和免疫分析可測定4-5份空白生物樣品的信號強(qiáng)度（光吸收度，熒光強(qiáng)度或放射性強(qiáng)度）以均值作為N,色譜分析可用空白樣品按樣品分析方法制備的溶液進(jìn)樣，記錄空白色譜圖。取相當(dāng)于藥物峰寬W20倍的一段基線，且范圍應(yīng)相當(dāng)于藥物峰最后一段，實(shí)際測定時(shí)刻增加記錄儀靈敏度，放大此段基線，然后以偏離基線平均噪音水平最大峰高的一半作噪音值，且應(yīng)重復(fù)幾次，用得到的均值N計(jì)算信/噪比S/N4?專屬性5?線性與范圍：標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯度的5-8個(gè)濃度（等比關(guān)系，非線性者如免疫分析可適當(dāng)增加），每個(gè)濃度只需測定一次（免疫分析可測定兩次并取平均）。一般濃度上限為樣品最高濃度的120%，下限為樣品最低濃度的80%但高于LOQ。在舍棄點(diǎn)時(shí)，應(yīng)從兩段舍，保證r合格（r>0.99,制劑分析HPLC：r>0.999）?專屬性specificity的操作與要求：1.生物基質(zhì)的影響【要求】：可取3個(gè)以上不同個(gè)體的空白樣品，考察正常生理情況下樣品中生物基質(zhì)的影響。色譜分析：要求藥物與內(nèi)標(biāo)峰附近無干擾峰；光譜分析：要求藥物測定波長處無雜質(zhì)吸收（或無雜質(zhì)熒光）；免疫分析：應(yīng)比較同量藥物加入空白體液和緩沖液中測值的差異，并盡量用參比方法（如色譜法）作對比。2.藥物代謝物的影響3.配伍藥物的影響4.參比方法對照【操作】：一般選用專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高的色譜法進(jìn)行對照。在對照比較時(shí)，通常是將同一批含藥濃度不同的藥品，用待考察方法測得濃度為縱坐標(biāo)y,參比方法為x，并且坐標(biāo)標(biāo)度相同，如此做成相關(guān)性圖。回歸方程為Y=a+bX,其中b表示測定結(jié)果相關(guān)性。等同線Y=bX（b=l）為等同線線性方程，表示兩方法測定結(jié)果完全相等。若回歸線越接近等同線，則待考察方法越接近參比方法；若b越接近1（a很小時(shí)），則考察方法越等同于參比方法。體內(nèi)藥物分析：體液藥物分析、生物藥物分析，滿足臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要，通過各種分析手段，了解藥物的體內(nèi)過程藥物代謝：藥物吸收和分布之后在血液或組織中的生物轉(zhuǎn)化過程。是溝通藥物化學(xué)和藥理學(xué)的橋梁。代謝產(chǎn)物：生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。生物轉(zhuǎn)化：藥物在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)質(zhì)控樣品：于空白生物基質(zhì)中加入不同濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成含藥物高中低三種已知濃度的QC樣品，并在穩(wěn)定條件下貯存。每個(gè)濃度應(yīng)測定兩次，要求得到6個(gè)測定值中至少4個(gè)落在已知濃度的±20%范圍內(nèi)，以此作為判斷本次樣品分析合格的標(biāo)準(zhǔn)中藥成分體內(nèi)分析意義（一） 進(jìn)行中藥血清化學(xué)和血清藥理學(xué)研究，闡明中藥體內(nèi)直接物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制的重要技術(shù)基礎(chǔ)。中藥學(xué)清化學(xué)和中藥學(xué)清藥理學(xué)為中藥體內(nèi)代謝研究的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。中藥體內(nèi)代謝研究的發(fā)展為中藥血清華夏和中藥血清藥理學(xué)的研究內(nèi)容提出了更高的要求。三者相輔相成將會(huì)對中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜性和作用機(jī)制復(fù)雜性的闡明提供關(guān)鍵的科學(xué)依據(jù)和方法、手段，為中藥現(xiàn)代化研究提供開拓性思維和方法。（二） 中藥成分生物轉(zhuǎn)化和代謝研究是新藥設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新的重要途徑。①吸收不良導(dǎo)致新藥開發(fā)失敗或成本增加②腸內(nèi)菌對藥物結(jié)構(gòu)的生物轉(zhuǎn)化、肝臟藥物代謝酶對藥物結(jié)構(gòu)的修飾導(dǎo)致藥物失效④不良的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、生物轉(zhuǎn)化或代謝產(chǎn)物產(chǎn)生毒性導(dǎo)致新藥開發(fā)失?、匏幬锎x酶基因多態(tài)性導(dǎo)致藥物效果的個(gè)體偏差和應(yīng)用受限?合理的藥物設(shè)計(jì)應(yīng)該充分考慮藥物代謝途徑及相關(guān)代謝特征，找出先導(dǎo)化合物的代謝hotspot通過對藥物生物轉(zhuǎn)化或代謝的有益發(fā)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)對先導(dǎo)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，以改善藥理作用，提高療效，降低毒性或增加穩(wěn)定性①體內(nèi)不代謝或僅經(jīng)水解酶代謝的新藥設(shè)計(jì)②對藥物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以防止其失活的新藥設(shè)計(jì)③合成有效代謝物或模擬有效代謝物結(jié)構(gòu)的新藥設(shè)計(jì)④仿生藥物轉(zhuǎn)化的新藥設(shè)計(jì)⑤據(jù)肝臟細(xì)胞色素P450代謝特點(diǎn)的新藥設(shè)計(jì)?從天然藥物生物轉(zhuǎn)化和代謝產(chǎn)物中篩選新藥更有利于新藥的源頭性創(chuàng)新其理想程序?yàn)椋褐兴?人種藥理學(xué)為先導(dǎo)-先導(dǎo)化合物-物理化學(xué)性質(zhì)-體外ADME-體內(nèi)ADME-毒性評價(jià)-可接受先導(dǎo)化合物-候選藥物-創(chuàng)始性藥物天然組合化合物庫/組合代謝產(chǎn)物庫-高通量篩選-活性再評價(jià)（三）藥物評價(jià)的重要內(nèi)容和技術(shù)基礎(chǔ)：藥代動(dòng)力學(xué)、生物利用度、安全性（四）臨床藥學(xué)和臨床藥理學(xué)賴以建立和發(fā)展的技術(shù)基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)手段特點(diǎn)：干擾雜質(zhì)多，樣品量少濃度低，不穩(wěn)定性，要求快速提供結(jié)果第一節(jié)中藥成分在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)一、 藥物體內(nèi)過程：吸收一血漿（D+P—DP藥物-蛋白復(fù)合物）、受體（作用部位：R+DoRD）、組織（貯存：D+ToDT）生物轉(zhuǎn)化（D+E藥物代謝酶oM代謝物）一排泄二、 中藥成分體內(nèi)存在狀態(tài)包括原型成分，原型成分經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生成的代謝產(chǎn)物，以及二者與生物大分子（如蛋白質(zhì)、受體）的結(jié)合物。在血液中只有未同蛋白質(zhì)結(jié)合的游離藥物才可以從血液自由的透過細(xì)胞膜，到達(dá)作用部位而發(fā)揮療效。藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合能減慢藥物從循環(huán)血液中的消失，起到藥物庫的作用。三、 藥物與血漿蛋白的結(jié)合藥物通過體液輸送到器官、組織，在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化過程中，可與組織蛋白（包括受體）和體液蛋白結(jié)合。因此研究藥物與體液蛋白的結(jié)合非常重要。在常見的體液樣品中，血漿、血清富含血漿蛋白。由于血漿、血清主要生化成分相近。二者均可作為分析樣品并常常能互相代替。D藥物+P血漿蛋白o(hù)DP藥物-蛋白復(fù)合物：藥物主要與白蛋白（清蛋白，血漿主要蛋白質(zhì)，占總量的一半）結(jié)合，極性小的脂溶性藥物可與脂蛋白結(jié)合可逆性：藥物與血漿蛋白的結(jié)合主要通過非共價(jià)鍵力，即依靠分子鍵氫鍵、范德華力等。因此是可逆過程，離解速度很快;非特異性：血漿蛋白能和很多藥物結(jié)合，多數(shù)酸性藥物與血漿白蛋白結(jié)合，堿性藥物除與白蛋白結(jié)合外，還能和酸性糖蛋白結(jié)合;競爭性：兩個(gè)藥物競爭血漿蛋白的同一結(jié)合部位，結(jié)合率高的可置換出結(jié)合律低的藥物；藥物的代謝產(chǎn)物也能競爭性取代與蛋白結(jié)合的母體藥物。另一方面，部分藥物也可以促進(jìn)血漿蛋白對另一藥物的親和力四、 血漿蛋白結(jié)合率及其測定結(jié)合平衡后，血漿中藥物總濃度（C總）分為兩部分：與血漿蛋白結(jié)合濃度（C結(jié)合）和游離血藥濃度（C游）蛋白結(jié)合率=C結(jié)合/C總=（C總-C游）/C總（一）透析法：將血清置于透析管中，懸于含藥物的緩沖液中，在一定溫度下靜置或持續(xù)震蕩數(shù)小時(shí)，達(dá)到平衡后，透析管內(nèi)外游離型藥物濃度相等，而管內(nèi)除含有游離型藥物外，還保留了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合物（結(jié)合型藥物）計(jì)算：測定管外溶液中藥物濃度（游離藥物濃度）和管內(nèi)藥物總濃度，兩者之差即為與血漿蛋白結(jié)合的藥物量。由此可計(jì)算出被測藥物的血漿蛋白結(jié)合率。蛋白結(jié)合率=（管內(nèi)藥物濃度-管外）/管內(nèi)注意：1?透析膜①型號選擇：由醋酸纖維素制成，應(yīng)根據(jù)截留分子量的大小選擇。②檢漏：加3%CC13COOH是否有沉淀③保存方法：新的干燥透析膜應(yīng)保存在密封的聚乙烯袋中，以防止受潮生霉。濕的用1%苯甲酸鈉或0.05%疊氮化鈉溶液防腐5°C保存。經(jīng)處理或使用的透析膜不允許其再次干燥，應(yīng)保存在50%甘油或乙醇中。2?預(yù)處理：①透析膜通常含10%水25%甘油0.1%硫化物。一般透析時(shí)只要浸泡潤濕并用蒸餾水充分洗滌，即可使用②硫化物去除：用10mmol/L碳酸氫鈉浸洗，用50%乙醇浸泡或煮沸③微量重金屬去除：10mmol/L的EDTA浸泡蛋白質(zhì)溶液：多用人或動(dòng)物的血漿，也可用白蛋白。一般用牛血紅蛋白3?緩沖溶液：磷酸鹽緩沖液（pH=7.4-7.5）濃度0.1-0.2mol/L當(dāng)藥物含有羧基或酚羥基時(shí)，磷酸鹽緩沖液濃度不能太高或太低，一般應(yīng)加入適量中性鹽，如0.15mol/L氯化鈉4?平衡溫度與時(shí)間：常用37°C/4°C/20°C,為縮短平衡時(shí)間，可采用震蕩平衡法，必要時(shí)需加適量防腐劑。平衡確定方法：取與血漿樣品液相同體積的透析液，放入另一只透析管中作對照，確定藥物管內(nèi)外自由擴(kuò)散達(dá)到平衡的時(shí)間5.影響因素①透析膜對藥物的吸附。檢查方法：透析管內(nèi)先盛入緩沖液（VI）管外加入已知藥物濃度為CA的緩沖液（V2）達(dá)到平衡時(shí)，測定管外藥物濃度CE，若符合CEvCAV2/（Vl+V2）則說明透析膜對藥物有明顯吸附，應(yīng)進(jìn)一步考察在不同濃度下藥物與半透膜的吸附程度，若吸附力與藥物濃度相關(guān)，則應(yīng)當(dāng)用相關(guān)曲線予以校正②donnan效應(yīng)：如果藥物帶電荷，蛋白質(zhì)也帶電荷，因電荷影響，可造成平衡時(shí)透析膜兩側(cè)游離藥物濃度不等。一般用高濃度緩沖液或中性鹽溶液作為透析液時(shí)可消除該反應(yīng)。但當(dāng)溶液pH值偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)太遠(yuǎn)，且蛋白質(zhì)濃度較高時(shí)，用高濃度緩沖液也不能消除時(shí)應(yīng)考慮對該效應(yīng)進(jìn)行校正（二） 超濾法：用超濾膜將結(jié)合型藥物和游離藥物分離。超濾裝置：用超濾膜將超濾裝置分為上下兩部分，膜上為貯樣室，下為收集管。裝樣后離心強(qiáng)迫游離藥物隨血漿中水分以及其他小分子物質(zhì)通過超濾膜影響因素及注意事項(xiàng)：超濾膜的選擇；超濾速度：3000-10000轉(zhuǎn)/分；超濾時(shí)間：5-15分；溫度：4/20/37C；超濾液體積：控制超濾后/超濾前體積比為0.3-0.6，因蛋白質(zhì)濃度變化會(huì)引起藥物蛋白結(jié)合率變化（三） 凝膠過濾法：將血漿樣品溶液通過葡聚糖凝膠住，將游離型藥物與結(jié)合型藥物分離。只用于測定與蛋白結(jié)合率高的藥物。注意選擇凝膠類型，柱溫，洗脫液種類，洗脫流速等。凝膠柱：常用葡聚糖凝膠類型有G-25/G-50/G-125。柱溫：20-37C。洗脫液：一般為緩沖液，如pH值為7.5的磷酸鹽緩沖溶液，也有用5.5的緩沖液洗脫酸性藥物。洗脫流速：0.3-1mL/min（四） 超速離心法：將血漿或血清直接加入離心管，高速離心（150000-250000rpm）下離心分離，上清液含游離型藥物，沉淀含結(jié)合型藥物。注意分離過程中存在反擴(kuò)散現(xiàn)象，溶液粘度影響分離效果，上清液中殘存蛋白的影響（五） 將白蛋白微球懸浮在緩沖溶液中，倒入底部具有孔板的注射器內(nèi)，加入藥物混勻溫敷一定時(shí)間，推注注射器活塞，游離藥物隨緩沖液通過孔板滴入收集器。此法在一定程度上可反映藥物的血漿蛋白結(jié)合率（白蛋白約占血漿蛋白的60%）第二節(jié)腸內(nèi)菌的生物轉(zhuǎn)化一、 水解反應(yīng)：腸內(nèi)進(jìn)行的主要生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，由腸內(nèi)菌具有的B-葡萄糖苷酶、B-鼠李糖苷酶、B-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶等催化完成。將苷在苷酶作用下轉(zhuǎn)化為苷元。二、 氧化反應(yīng)：腸內(nèi)菌對中藥成分的氧化生物轉(zhuǎn)化，最典型的例子是黃酮類化合物。不同類型黃酮類化合物由腸內(nèi)菌氧化轉(zhuǎn)化引起的骨架開裂具有一定規(guī)律性。A.黃酮一C6-C3型酚酸；B.黃酮醇一C6-C2型酚酸；C.二氫黃酮一C6-C3型酚酸；D.異黃酮一乙基酚衍生物；E.黃烷醇一C6-C3型酚酸（經(jīng)過苯基-B-戊酸內(nèi)酯中間體）；F.花色素一C6-C1型酚酸三、 還原反應(yīng)：硝基還原酶和亞硝基還原酶，腸內(nèi)菌含有豐富，而肝臟不含有。其他還原酶如3B-羥基甾體脫氫酶四、 異構(gòu)化反應(yīng)：光學(xué)活性和立體選擇性轉(zhuǎn)化五、 含氧化合物向含氮化合物的轉(zhuǎn)化：腸內(nèi)菌可使某些含氧化合物轉(zhuǎn)化為含氮化合物，其中氮元素來源于腸內(nèi)菌氮代謝產(chǎn)生的氨。環(huán)烯醚萜類化合物主要存在該轉(zhuǎn)化。六、 脫?；ソ猓┳饔茫耗c內(nèi)菌中含有酯酶，可進(jìn)行~七、 酯化作用：與酯解作用相反，某些腸內(nèi)菌也能將自身胞壁組成成分脂肪酸與藥物結(jié)合產(chǎn)生新的酯，如烏頭堿的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化。八、 聚合作用：當(dāng)某些中藥成分生物轉(zhuǎn)化中間體反應(yīng)活性較高時(shí)，它們之間也能聚合形成穩(wěn)定的終產(chǎn)物，如紫草素的人腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化第三節(jié)肝臟代謝和生物轉(zhuǎn)化親脂性化合物雖然易于透過細(xì)胞膜被消化道吸收，但不易從腎臟排出，堆積體內(nèi)造成毒害作用，只有經(jīng)肝臟等器官的氧化還原水解結(jié)合等一系列代謝反應(yīng)轉(zhuǎn)為極性大的化合物，使之易于排出體外。大部分藥物的肝臟代謝是滅活過程。個(gè)別藥物的肝臟代謝可增強(qiáng)活性，如嗎啡。一、 藥物代謝的氧化反應(yīng)：最重要最普遍。某些氧化反應(yīng)由線粒體和細(xì)胞之中的脫氫酶或氧化酶催化；大部分氧化反應(yīng)由肝臟線粒體單加氧酶末端酶系細(xì)胞色素P450催化C-烷基的氧化:①被單加氧酶將末端甲基及其臨危亞甲基氧化，生成相應(yīng)醇，多數(shù)情況下醇繼續(xù)被脫氫酶氧化，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸或酮②若短鏈甲基和乙基烷烴直接結(jié)合到雙鍵和芳香環(huán)上，結(jié)合部位容易氧化③甲基、亞甲基和次甲基的氧化活性依次降低N-烷基的氧化：微粒體FAD-單加氧酶（胺氧化酶）催化許多化合物中的N氧化，催化仲胺的羥基化和叔胺、羥胺的氧化。伯胺：首先生成羥胺，再繼續(xù)氧化成亞硝基和硝基化合物。仲胺：氧化成羥胺再進(jìn)一步生成不穩(wěn)定的氮羰化合物，后水解成醛和一元羥胺。叔胺：氧化生產(chǎn)N-氧化物。脂肪環(huán)的羥基化：脂肪環(huán)化合物由于具有亞甲基結(jié)構(gòu)，同直鏈狀烷烴一樣抑郁氧化代謝。芳香環(huán)的氧化：芳香環(huán)上的氫被羥基取代是芳香環(huán)氧化的特征，又稱羥基化反應(yīng)。電子密度高的部位優(yōu)先氧化雙鍵的氧化：雙鍵臨危的亞甲基易于被氧化代謝，但雙鍵本身也能夠被氧化代謝生成環(huán)氧化物。在生物體中形成的該類環(huán)氧化物可迅速被存在于肝微粒體或肝細(xì)胞可溶部分的環(huán)氧化物水解酶分解。環(huán)氧化物常與生物體內(nèi)源性大分子蛋白質(zhì)以及核酸等共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致組織壞死和癌變二、 藥物代謝的還原反應(yīng)：能夠進(jìn)行還原反應(yīng)的官能團(tuán)有硝基、偶氮基、羰基、烯基、N-氧化物、S-氧化物、環(huán)氧化物、過氧化物等。醛-酮還原酶：羰基化合物（醛、酮）羰基變?yōu)榱u基。硝基還原酶：芳香硝基化合物變?yōu)榉及?，偶氮化合物變?yōu)榘?。三?藥物代謝的水解反應(yīng)（一） 環(huán)氧化物的水解。環(huán)氧化物的環(huán)氧三元環(huán)應(yīng)力大，反應(yīng)性強(qiáng)，可與多種生物體成分發(fā)生親電反應(yīng)而使細(xì)胞壞死、突變、癌變。生物體防御這種有害反應(yīng)發(fā)生的酶類有環(huán)氧化物水解酶，將環(huán)氧化物催化為反式鄰二醇。（二） 糖苷鍵的水解：糖苷鍵水解是糖和苷類化合物進(jìn)入生物體后最普遍的反應(yīng)?？诜o藥，水解反應(yīng)主要發(fā)生在胃腸道內(nèi)。靜脈給藥，主要發(fā)生在肝臟和腸肝循環(huán)。（三） 酯基的水解：能夠水解酯鍵的酶稱為酯酶。（四） 酰胺基的水解：能夠水解酰胺鍵的酶稱為酰胺酶。酰胺酶和酯酶沒太大區(qū)別，但酰胺酶水解慢。四、 藥物代謝的結(jié)合反應(yīng)：藥物經(jīng)過第一相的氧化、還原水解等生物轉(zhuǎn)化，代謝物進(jìn)入第二相與生物內(nèi)源性分子如葡萄糖醛酸、硫酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸或其他氨基酸、硫氰酸鹽結(jié)合或乙?；⒓谆?，生成水溶性的無藥理作用（一般來說）的產(chǎn)物，從尿液或膽汁排出。使極性增加：葡萄糖醛酸、磷酸、氨基酸、谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)；氨基酸結(jié)合反應(yīng)：甘氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸等與游離羧基結(jié)合。谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)受谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化。五、 甲基化反應(yīng)：有O-/N-/S-甲基化反應(yīng)，分別由O-/N-/S-甲基轉(zhuǎn)移酶催化。六、 乙酰化反應(yīng)：含氨基藥物，由乙酰基轉(zhuǎn)移酶催化完成。以氧化反應(yīng)為主。屬底物非專一性反應(yīng)，反應(yīng)底物種類多。代謝產(chǎn)物極性、水溶性增大。代謝反應(yīng)競爭性與序列性并存、相互交叉、代謝反應(yīng)是多因素綜合作用的結(jié)果。第四節(jié)體內(nèi)分析樣品制備三、生物樣品預(yù)處理目的：使待測成分處于綴合狀態(tài)；考慮因素：待測成分的酸堿性、極性、穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)結(jié)合度；濃度高低、分析方法；生物樣品性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的去除A?沉淀法：a.有機(jī)溶劑沉淀法：①常用有機(jī)溶劑有乙腈、丙酮、乙醇、甲醇等，沉淀蛋白的效力遞減②用1-3倍體積的有機(jī)溶劑可使90%以上蛋白質(zhì)沉淀。b.鹽析法：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉。c.酸性試劑沉淀法：常用酸性試劑：三氯醋酸（最常用，但常含雜質(zhì)，只是有些方法的空白值偏高，其次是出去蛋白質(zhì)后如采用乙醚為提取溶劑，三氯醋酸會(huì)融入乙醚干擾測定）、高氯酸、苦味酸等。d.加熱沉淀法：適用于樣品對熱穩(wěn)定者酶消化法：①在溫和的理化條件下，水解生物蛋白，將與蛋白結(jié)合的成分釋放，對蛋白結(jié)合率強(qiáng)的成分可顯著改善回收率②避免成分在強(qiáng)酸下水解和較高溫度時(shí)降解③采用HPLC檢測時(shí)，無須進(jìn)行過多凈化操作④常用的蛋白水解酶有枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶⑤枯草菌溶液（細(xì)菌性堿性蛋白分解酶）最常用，pH7.0-11.0內(nèi)使蛋白質(zhì)降解，50-60°C活性最大⑥加入蛋白酶激活劑可減少酶用量和縮短活化時(shí)間，如咖啡因與胃蛋白酶合用氯化鈣與胰蛋白酶合用C?超濾法、透析法、微孔濾膜過濾法：①與蛋白結(jié)合的待測成分未能被解脫出來而不能檢出②用于測定血清或血漿中游離待測成分的濃度4?綴合物（結(jié)合物）水解A?酸水解：①通常用無機(jī)酸②酸濃度、水解時(shí)間、是否加熱等條件隨成分而異③簡便快速，但與酶水解相比專一性較差④注意成分在水解過程中是否發(fā)生分解B?酶水解：①常用水解酶有葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，在世界應(yīng)用中多用混合酶②水解方法：pH4.5-7條件下加入酶，37C厭氧條件下溫育16小時(shí)③尿液采用酶水解，需預(yù)先出去尿中能抑制酶活性的陽離子④優(yōu)點(diǎn)：專屬性強(qiáng)，條件溫和，不易引起待測成分降解⑤缺點(diǎn)：用時(shí)長，用量大，酶制劑可能引入粘液蛋白等雜質(zhì)，使綴合物乳化造成層析柱阻塞C?溶劑解：某些成分的硫酸酯，可在萃取溶劑的作用下發(fā)生分解四、生物樣品提取凈化1.液相提?。ㄒ?液提?。┨崛÷剩ㄝ腿÷剩┰隗w內(nèi)成分分析中，由于樣品量少且成分含量低，待分析樣品數(shù)量較多，通常不采用反復(fù)提取的方法，多進(jìn)行一次提取，因此成分提取率不可能太高，就一般分析而言，提取率不低于50%影響提取率的因素：提取溶劑①理想的提取溶劑對待測成分應(yīng)具有大的親和力；與水不互溶；不影響分析檢測；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；沸點(diǎn)適宜，價(jià)廉無毒②為了減少容器對待測成分的吸附損失，提高提取率，可在非極性提取溶劑中加少量醇水相pH值①對于酸堿性成分的提取率影響很大②pH的選擇主要根據(jù)待測成分的pka決定。一般來說，堿性成分的最佳pH應(yīng)高于pka2-3個(gè)單位；中形成反可在任一pH條件下被提取,但以在pH偏高的情況下進(jìn)行提取最好③為保證提取率的重現(xiàn)性，多采用緩沖溶液，以保持在提取過程中溶液pH穩(wěn)定離子強(qiáng)度：①離子強(qiáng)度增加（鹽析）有利于提高提取率②采藥離子鹽析效率由大到?。篗gCaSrBaLiNaKRbCs陽離子；枸緣酸根、酒石酸根、硫酸根、AcCl硝酸根氯酸根ISCN陰離子提取技術(shù)：①通常不采用反復(fù)提取，多半進(jìn)行至多兩次提取，在用酸堿回提時(shí)也只進(jìn)行一次，一般不考慮提盡藥物②提取溶劑必須精確加入，提取液要定量分出，其他操作應(yīng)與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同，并進(jìn)行平行操作③多采用內(nèi)標(biāo)加入法，即在樣品提取前，在各樣品中加入等量內(nèi)標(biāo)物，以待測組分響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值之比對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行定量④有機(jī)溶劑與水相的體積比一般為1:1或2:1⑤混合方式：密塞情況下振蕩器振蕩，渦動(dòng)混合器旋搖或首尾顛倒混合⑥玻璃容器表面會(huì)對成分產(chǎn)生吸附，為減少吸附可在提取溶劑中加少量異戊醇、二乙胺等，或?qū)ΣＡx器進(jìn)行硅烷化處理離子對提取法的提取條件反離子①烷基或芳基磺酸鹽、無機(jī)酸根等；用于呈陽離子狀態(tài)的成分②4-12個(gè)碳原子的烷基胺類；用于呈陰離子狀態(tài)的成分或代謝物，如酸性成分萃取溶劑：常用氯仿、二氯甲烷水相pH值①對離子對萃取有很大影響②最適宜pH應(yīng)使成分完全解離③為保證提取率的重現(xiàn)性，多采用緩沖溶液,以保持在提取過程中溶液pH穩(wěn)定離子對提取方法的應(yīng)用①適用于高度店里的親水性強(qiáng)的極性化合物提取，如尿液中水溶性大的綴合物②用于生物樣品中痕量成分的提取有獨(dú)到之處2．固相提?。ㄒ?固提取）固相柱親脂型：活性炭、氧化鋁、氧化鎂、硅膠、鍵合相硅膠（烷基鍵合相、苯基鍵合相、氰基鍵合相）大孔吸附樹脂親水型：纖維素、硅藻土、硅膠（原理：分配作用，用與水不相混溶的有機(jī)溶劑洗脫親脂性待測成分，親水性雜質(zhì)被滯留在固定相支持物上）離子交換型①陰離子交換樹脂：在中性、堿性條件下用于弱酸性成分②陽離子交換樹脂：在中性、酸性條件下用于弱堿性成分填料：①形狀：子彈型、針筒型②規(guī)格：填料量0.05-10g不等；體積1-60ml不等根據(jù)樣品體積大小，被測成分的含量及理化性質(zhì)選擇①一般樣品體積小于1ml選用1ml固相柱；1-250mlf3ml；快速萃取時(shí)，選用6ml固相柱②被萃取成分量一般不超過填料量的5%⑴反相柱：先用固定相6-10倍量體積的甲醇或乙腈沖洗，濕潤固相填料，使其溶劑化，然后用6-10倍量體積的水或緩沖液沖洗（此溶劑的極性、pH、離子強(qiáng)度應(yīng)與樣品液相似）使其達(dá)到良好的分離狀態(tài)⑵正相柱：采用固定相6-10倍量體積的非極性溶劑沖洗（通常用樣品溶劑來處理）⑶離子交換固定相：一般用水或弱緩沖溶劑處理將樣品溶于弱溶劑（如緩沖溶劑）中，緩慢加到固相柱上用強(qiáng)度適當(dāng)?shù)娜跞軇ㄈ绾倭考状嫉乃┫礈?，使待測組分保留著固相柱上，洗去雜質(zhì)，然后通氮?dú)饬鞲稍锕滔嘀淖兿疵撊軇┑臉O性或pH,使待測成分從固相柱上解吸附，隨洗脫液流出，收集洗脫液影響固相提取的因素①合適的洗滌劑和洗脫劑②流速：流速太快會(huì)使待測成分與吸附劑不能充分接觸,導(dǎo)致與雜質(zhì)的分離度下降，樣品流失，回收率降低或不能重現(xiàn)③上樣量：超載易引起回收率差或不穩(wěn)定,判斷是否超載,可進(jìn)行樣品突破性實(shí)驗(yàn)。方法為：取已知濃度樣品液；小體積上柱，用合適的洗脫方式洗脫；測定百分回收率；增大樣品上樣體積，重復(fù)前面步驟。繪制回收率與樣品上樣體積曲線，當(dāng)回收率下降時(shí)，表明樣品超載固相提取的優(yōu)點(diǎn)①無乳化現(xiàn)象，待測成分不易損失②溶劑用量少③萃取效能和回收率高④操作安全省時(shí)速度快，引入污染少⑤選擇合適的溶劑洗滌后，可再生重復(fù)使用固相提取的發(fā)展趨向：想著操作更簡便，易于自動(dòng)化的方向發(fā)展；方法：將提取柱與HPLC/GC系統(tǒng)相連，采用柱切換技術(shù)，可以達(dá)到自動(dòng)化的樣品處理。樣品自動(dòng)處理系統(tǒng)中，填料多為C18（粒徑30-40》m）血清或血漿樣品可直接進(jìn)樣，提取柱一般長度為2cm,對脂溶性很強(qiáng)的待測成分可采用更短的柱第五節(jié)體內(nèi)分析方法建立評價(jià)一、 樣品測定：對照品、對照品加水、空白、空白加對照、樣品二、 藥物分析方法評價(jià)指標(biāo)：準(zhǔn)確度、精密度、檢測限和定量限、專屬性、藥物穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)性、耐用性、樣品測定（QC樣品）1.準(zhǔn)確度A.回收率⑴提?。ㄝ腿?絕對）回收率＞50%能穩(wěn)定與重現(xiàn):往空白生物基質(zhì)或含藥物的真實(shí)樣品中加入的藥物標(biāo)準(zhǔn)品已知量A，實(shí)際上是準(zhǔn)確加入已知濃度的藥品標(biāo)準(zhǔn)品溶液一'定體積，使兩種考核樣品內(nèi)含總藥濃應(yīng)包括高中低三種，其濃度分別接近公示樣品的最高藥濃Cmax（標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限）、平均藥濃和最低藥濃Cmin（定量限）每個(gè)濃度應(yīng)測定3-5次，并且測定值M的相對標(biāo)準(zhǔn)差符合以下精密度項(xiàng)下的要求，然后取均值M。內(nèi)標(biāo)法中，內(nèi)標(biāo)物提取回收率與待測物不相差10%萃取回收率測定方法①對比法：取甲（尖底）乙兩支試管，各精密加入等體積的藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液（一般為甲醇溶液）然后通空氣或氨氣揮干，甲作對照，乙中準(zhǔn)確加入空白體液一①樣品：大黃素制劑②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：狗③給藥途徑：口服色譜條件的確定：采用HPLC法，確定流動(dòng)相等成分，熒光法測定。柱溫：室溫。血漿樣品的制備：取得全血后加入抗凝劑后離心取得上清液即血漿，立即冷凍貯存?zhèn)溆?。含藥血漿測定。不同時(shí)間點(diǎn)對含藥血漿進(jìn)行相關(guān)測定，繪制時(shí)效曲線。使用時(shí)采用液液萃取法預(yù)處理血漿并進(jìn)行萃取回收率樣品藥物回收率的測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯