流式細(xì)胞術(shù)之基本原理及運(yùn)用

主要內(nèi)容一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的光信號(hào)檢測流式分選二、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.1流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測對象：單細(xì)胞懸液或生物顆粒；檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測特點(diǎn)：單細(xì)胞水平分析；檢測速度：高速，最高達(dá)上萬個(gè)細(xì)胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好；可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選；流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式細(xì)胞分析-流動(dòng)式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)(解決難題)；1956Coulter原理(血細(xì)胞計(jì)數(shù)器)；1965Kamentsky:分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用；1967Kamentsky等設(shè)計(jì)了細(xì)胞分選的裝置；1969Vandilla等:第一臺(tái)熒光檢測細(xì)胞計(jì)(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)；1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:單克隆抗體技術(shù)(促進(jìn)流式發(fā)展)。流式細(xì)胞儀的分類分析型流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。1.2流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)光路系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器1.2.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測區(qū)。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖流式細(xì)胞儀液流系統(tǒng)示意圖流動(dòng)室流動(dòng)室(flowcell,flowchamber)是流式細(xì)胞儀的核心部件。流動(dòng)室中，被測細(xì)胞逐個(gè)通過，并在此與激光正交。進(jìn)樣孔熒光信號(hào)激光束鞘液Sheath流動(dòng)室結(jié)構(gòu)圖：單細(xì)胞發(fā)生器1.2.2光路系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器激光特點(diǎn)：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照?，F(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器（二）光束成行系統(tǒng)FCM的單細(xì)胞照明技術(shù)：這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證樣本中的細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到最大光照。11（三）光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/504605005404605005401.2.3電子系統(tǒng)光信號(hào)電信號(hào)數(shù)字信號(hào)（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強(qiáng)信號(hào)（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號(hào)（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（二）電信號(hào)兩種放大方式由于光信號(hào)比較弱，需將其等比例放大，方便計(jì)算機(jī)分析處理，一般信號(hào)的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號(hào)變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。通道(channel)

一個(gè)光電檢測器就是一個(gè)通道，有多少個(gè)光電二極管/倍增管，就有多少個(gè)通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。小結(jié)：

液流系統(tǒng)分析型流式結(jié)構(gòu)光路系統(tǒng)

電子系統(tǒng)161.3流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)檢測光信號(hào)的類型散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號(hào)自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。1.3.1散射光信號(hào)（一）前向散射光FSC

FSC信號(hào)方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號(hào)強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。19（三）散射光的作用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片（三）閾值Threshold閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細(xì)胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號(hào)，所以必須設(shè)置閾值，排除雜質(zhì)、細(xì)胞碎片或體積較小的死細(xì)胞。FSC反映細(xì)胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時(shí)常選取FSC設(shè)定閾值。5%32%默認(rèn)閾值升高閾值后1.3.2熒光信號(hào)（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜（二）常用熒光素<499nm藍(lán)色熒光（Blue）；500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；≥700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。23（三）熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體流式細(xì)胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定)。如PARTECCyFlowSpace分析模塊：多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個(gè)通道只能選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。

B根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇抗體不同的熒光素強(qiáng)度有所不同；高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進(jìn)行組合，同時(shí)需要正確的調(diào)節(jié)補(bǔ)償。CD51.5流式分選

電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板電荷式分選裝置PARTEC

分選模塊PPCSPiezoHV:400~560分選指標(biāo)分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選時(shí)間由三方面決定：進(jìn)樣速度、目標(biāo)細(xì)胞所占比例、需要收集的細(xì)胞數(shù)。分選時(shí)間表(機(jī)器流速10000個(gè)/s時(shí))分選純度指被分選出來的細(xì)胞所占的百分比，一般能達(dá)99%以上。分選收獲率是指被分選出的細(xì)胞與原來總細(xì)胞的百分比。分選純度和收獲率永遠(yuǎn)是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)純化模式(purifymode)單細(xì)胞模式(singlecellmode)2流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用FCM可檢測下列細(xì)胞成分：表面標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物可溶性成分