流式細胞術(shù)之基本原理及運用

主要內(nèi)容一、流式細胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細胞術(shù)簡介流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細胞儀的光信號檢測流式分選二、流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.1流式細胞術(shù)簡介流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細胞儀（FlowCytometer）是集細胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞術(shù)的特點檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒；檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測特點：單細胞水平分析；檢測速度：高速，最高達上萬個細胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準確性好；可對目標細胞進行分選；流式細胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式細胞分析-流動式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)(解決難題)；1956Coulter原理(血細胞計數(shù)器)；1965Kamentsky:分光光度計定量細胞成分和散射光應(yīng)用；1967Kamentsky等設(shè)計了細胞分選的裝置；1969Vandilla等:第一臺熒光檢測細胞計(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細胞分選儀(FACS)；1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流式細胞儀-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:單克隆抗體技術(shù)(促進流式發(fā)展)。流式細胞儀的分類分析型流式細胞儀細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細胞進行分選；進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細胞儀一般只用于分選。1.2流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)光路系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器1.2.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。鞘液鞘液細胞流激光照射點流體動力學(xué)聚焦示意圖流式細胞儀液流系統(tǒng)示意圖流動室流動室(flowcell,flowchamber)是流式細胞儀的核心部件。流動室中，被測細胞逐個通過，并在此與激光正交。進樣孔熒光信號激光束鞘液Sheath流動室結(jié)構(gòu)圖：單細胞發(fā)生器1.2.2光路系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照?，F(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器（二）光束成行系統(tǒng)FCM的單細胞照明技術(shù)：這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證樣本中的細胞是一個一個分別受到最大光照。11（三）光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/504605005404605005401.2.3電子系統(tǒng)光信號電信號數(shù)字信號（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強信號（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。通道(channel)

一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管/倍增管，就有多少個通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。小結(jié)：

液流系統(tǒng)分析型流式結(jié)構(gòu)光路系統(tǒng)

電子系統(tǒng)161.3流式細胞術(shù)光信號檢測光信號的類型散射光信號：與標記熒光素?zé)o關(guān)，是細胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。1.3.1散射光信號（一）前向散射光FSC

FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。19（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細胞、死細胞和碎片（三）閾值Threshold閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號，所以必須設(shè)置閾值，排除雜質(zhì)、細胞碎片或體積較小的死細胞。FSC反映細胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時常選取FSC設(shè)定閾值。5%32%默認閾值升高閾值后1.3.2熒光信號（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜（二）常用熒光素<499nm藍色熒光（Blue）；500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；≥700nm，遠紅外熒光（Far-Red）。23（三）熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細胞儀選擇抗體流式細胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定)。如PARTECCyFlowSpace分析模塊：多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。

B根據(jù)抗原表達強弱合理選擇抗體不同的熒光素強度有所不同；高表達的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進行組合，同時需要正確的調(diào)節(jié)補償。CD51.5流式分選

電荷式分選超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板電荷式分選裝置PARTEC

分選模塊PPCSPiezoHV:400~560分選指標分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選時間由三方面決定：進樣速度、目標細胞所占比例、需要收集的細胞數(shù)。分選時間表(機器流速10000個/s時)分選純度指被分選出來的細胞所占的百分比，一般能達99%以上。分選收獲率是指被分選出的細胞與原來總細胞的百分比。分選純度和收獲率永遠是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)純化模式(purifymode)單細胞模式(singlecellmode)2流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用FCM可檢測下列細胞成分：表面標記物胞漿標記物核內(nèi)標記物可溶性成分