第二章 發(fā)酵工業(yè)菌種改良1

第四節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種改良菌種改良技術(shù)的進步是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的技術(shù)支撐。所以，育種工作者的任務(wù)就是在不損及微生物基本生命活動的前提下，采用物理、化學或者生物學以及各種工程學的方法，改變微生物的遺傳結(jié)構(gòu)，打破原有的代謝機制，使之成為“浪費型”菌株。同時，按照人們的需要和設(shè)計安排，進行目的產(chǎn)物的過量生產(chǎn)，最終實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的目的。目的提高生產(chǎn)能力提高產(chǎn)品質(zhì)量開發(fā)新產(chǎn)品解決生產(chǎn)實際問題防止菌種退化方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、DNAShuffling等一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。狹義突變：基因突變—點突變廣義突變：基因突變和染色體畸變突變的幾率：10-6---10-9

野生菌株---突變-----突變株選擇性突變

非選擇型突變（一）基因突變類型（表型分類）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）條件致死突變（株）營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性的突變株。條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（二）突變率每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。（三）基因突變的特點以細菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響。可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳?？赡嫘裕赫蛲蛔兟?回復突變率（四）基因突變的機制自發(fā)突變誘發(fā)突變二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種1、生產(chǎn)中育種10-6突變率---尋找正向突變菌株2、定向培育優(yōu)良菌種牛型結(jié)核桿菌------13年----230代----卡介苗（減毒活菌疫苗）（二）誘變育種誘變+篩選誘變是隨機的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株都是經(jīng)過突變改造過的。1、誘變育種的基本規(guī)律2、誘變育種中的幾個原則誘變劑的選擇誘變基本過程誘變劑劑量的選擇誘變劑的處理方法突變株的篩選（1）誘變劑的選擇誘變劑作用的普遍性：在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV亞硝基胍（NTG），快中子誘變劑的特異性：經(jīng)驗之談

四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．菌株的差異：（即使是同一菌）

A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株------用緩和誘變劑B：遺傳性穩(wěn)定的菌株-----首用強，后用緩?？紤]誘變機制：

UV嘧啶，亞硝酸嘌呤，因此復合用為好（2）誘變基本過程選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株應(yīng)具備①對誘變劑的敏感性高；②具有特定性狀的生產(chǎn)能力◆出發(fā)菌株的來源①自然界分離到的野生型菌株：②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株：③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：制備單細胞或單孢子懸液要求

①菌體處于對數(shù)生長期，

②細胞分散且為單細胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：物理誘變劑——生理鹽水

化學誘變劑——緩沖液

濃度：細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml（3）誘變劑劑量的選擇用50—85%的殺菌劑量，此時正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產(chǎn)菌株誘變劑的劑量對產(chǎn)量變異影響的可能結(jié)果a.未經(jīng)誘變劑處理；b.變異幅度擴大，但正負突變相等；c.正突變占優(yōu)勢；d.負突變占優(yōu)勢（4）誘變劑的處理方法誘變劑使用方式

單一處理

復合處理

誘變處理條件：溫度（生長溫度）

PH（緩沖劑）處理時間誘變作用的終止：用解毒劑、用水稀釋（5）突變株的篩選篩選條件：基因型+環(huán)境=表型表型遲延充分表達分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象（5）突變株的篩選合適的篩選方法：平皿快速檢測法變色圈法透明圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法搖瓶培養(yǎng)法第一輪：一個出發(fā)菌株→→→選出200個菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩

（每瓶一株）復篩（每瓶四株）第二輪：5個出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復篩（每瓶一株）（每瓶四株）3、三類突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選抗藥性突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型的篩選

（1）產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）孢子懸液------誘變----適當培養(yǎng)（表型遲）-涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)4-5天—測定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----效價高菌（2）抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）抗藥性突變株的應(yīng)用：*作為菌株的遺傳標記*作為生產(chǎn)菌種

（結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株）如“吡哆醇高產(chǎn)菌株的篩選”（3）營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選A：有關(guān)的三類遺傳型個體：營養(yǎng)缺陷型突變株：野生型菌株：原養(yǎng)型菌株：B有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。

補充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。C營養(yǎng)缺陷型的篩選步驟C-1：誘變處理（同前講述）C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）C-3：檢出缺陷型

C-4：鑒定缺陷型C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）（1）抗生素法野生型菌株在MM上生長+青霉素—殺死Ｇ＋缺陷型菌株在MM上不生長＋青霉素—-不殺死制霉菌素法則適合于真菌抗生素處理完后，離心收集細胞，并轉(zhuǎn)入低滲溶液（2）菌絲過濾法適于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：野生型基本培養(yǎng)基上發(fā)育成菌絲；缺陷型孢子不萌發(fā)可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。C-3:檢出缺陷型逐個檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補給法逐個檢出法

影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補給法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),大菌落為野生型小菌落的為缺陷型。C-4:鑒定缺陷型生長譜法組合營養(yǎng)物法組合補充培養(yǎng)基法生長譜法斜面菌種-----生理鹽水洗下細胞------洗滌-----涂布（105個/皿）紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液組合營養(yǎng)物法：A將多種營養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結(jié)果分析；一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415一組：1

2345

二組：26

789

三組：37