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文檔簡介
《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理。2、學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法和技術(shù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理
1、感受態(tài)細(xì)胞制備原理:受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2、RbCl等化學(xué)試劑法)處理后,細(xì)菌會(huì)膨脹成球形,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。(Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu),促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區(qū)域)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2、感受態(tài)轉(zhuǎn)化原理:細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,同時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA會(huì)形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)過42℃短時(shí)間的熱激處理,促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物,在培養(yǎng)液中生長數(shù)小時(shí)后,球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖,在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子??笰mp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)離心設(shè)備臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)制冰機(jī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑1、實(shí)驗(yàn)材料:E.
coliJM109。2、實(shí)驗(yàn)試劑:LB液體培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加雙蒸水至總體積1L,高壓下蒸氣滅菌。(2)0.1mol/LCaCl2溶液:稱取1.1098gCaCl2(無水,分析純),溶于90mL重蒸水中,定容至100mL,高壓滅菌。(3)30%甘油:量取30mL甘油,加入70mL雙蒸水,混勻,定容至100mL,高壓滅菌。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟菌體的培養(yǎng)(事先已做)受體菌的培養(yǎng)從
LB平板上挑取新活化的E.coli
JM109單菌落,接種于3~5
mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)
12hr左右,直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以
1:
100~1:
50
的比例接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2~3hr,至OD600為0.3~0.4。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)取2個(gè)1.5mL離心管,分別轉(zhuǎn)入1mL菌液,4℃12000rpm,離心2min。棄去上清,每管加入1mL預(yù)冷的
0.1mol/L
CaCl2
溶液,懸浮細(xì)胞,冰上放置
30min。4℃
,12000rpm,離心2min。棄去上清,每管加入50μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2
溶液,輕緩懸浮細(xì)胞,50μL預(yù)冷的30%甘油,冰上放置5min,即為感受態(tài)細(xì)胞懸液。將感受態(tài)細(xì)胞懸液,放置于-80℃,可保存半年。2.感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2
法,超凈臺(tái)內(nèi))分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第二天,CaCl2
法前一天晚上,第二天早上菌體的活化感受態(tài)的制備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)每人2管感受態(tài)細(xì)胞結(jié)果分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌,最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為宜,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。JM109菌株的OD600為0.3-0.4密度比較合適,密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心,懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔
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