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文檔簡介
堿性磷酸酶
的動(dòng)力學(xué)分析酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué):研究各種因素對酶促反應(yīng)速率的影響,并加以定量的闡述。影響因素包括:酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。堿性磷酸酶
米氏常數(shù)的測定原理米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中的一個(gè)相當(dāng)重要的常數(shù),通過實(shí)驗(yàn),可理解并掌握利用實(shí)驗(yàn)求出Km的方法。在酶促反應(yīng)中,當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH及酶濃度恒定時(shí),底物濃度對反應(yīng)速率的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。米氏方程式:反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式
。[S]:底物濃度V:不同[S]時(shí)的反應(yīng)速率Vmax:最大反應(yīng)速率(maximumvelocity)
Km:米氏常數(shù)(Michaelisconstant)
VVmax[S]
Km+[S]=──VmaxV[S]KmVmax/2Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度,單位是mol/L。酶底物復(fù)合物E+SE+PES(過渡態(tài))
Vmax[S]Km+[S]V=(林-貝氏方程)+1/V=KmVmax
1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)雙倒數(shù)作圖法-1/Km
1/Vmax1/[S]1/V本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶(AKP)為材料,用磷酸苯二鈉為其底物。AKP催化磷酸苯二鈉水解產(chǎn)生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用,經(jīng)鐵氰化鉀氧化,可生成紅色的醌衍生物。根據(jù)紅色的深淺可測出酚的含量,進(jìn)而算出相應(yīng)的酶活性(V)。再根據(jù)Lineweaver—Burk法作圖,計(jì)算其Km值。操作
底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響
1)取試管8支,按下表操作(應(yīng)特別注意準(zhǔn)確吸取底物溶液及酶液):加入酶液立即計(jì)時(shí),混勻后置37℃水浴準(zhǔn)確保溫15min。2)保溫結(jié)束,各管立即加入堿性溶液1ml以終止反應(yīng)。3)各管中分別加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5%鐵氰化鉀2ml,混勻,放置l0min,以第8管調(diào)零點(diǎn),于510nm波長處比色,測定各管吸光度。酶促反應(yīng)速度計(jì)算酶促反應(yīng)速度以每15分鐘所產(chǎn)生酚的微克數(shù)(μg
/15min)來表示。根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線查出各管的酚含量,即各管在不同底物濃度下的反應(yīng)速度。本實(shí)驗(yàn)不制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,而以1/[S]對1/A作圖,因各管吸光度與其酚含量成正比,故可用吸光度代表酶促反應(yīng)速度。注意事項(xiàng)(1)底物濃度和酶濃度都對酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生巨大影響,故該實(shí)驗(yàn)的成功與否,在很大程度上取決于各種試劑(特別是底物溶液和酶液)吸液量的準(zhǔn)確性。(2)
加入酶液立即計(jì)時(shí),混勻后置37℃水浴準(zhǔn)確保溫15min。
實(shí)驗(yàn)記錄堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定日期、室溫A
12345678
0.000實(shí)驗(yàn)報(bào)告
堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定日期室溫一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、數(shù)據(jù)處理(一)繪制米氏方程式曲線(二)繪制雙倒數(shù)曲線四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:AKP的Km=五、實(shí)驗(yàn)討論(一)繪制米氏方程式曲線A
123456780.000Smmol/L234568160VVmax[S]
Km+[S]=──AKP米氏方程式曲線圖A[S](二)繪制雙倒數(shù)曲線1/A
12345678
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