五年制堿性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)分析

堿性磷酸酶

的動(dòng)力學(xué)分析酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響，并加以定量的闡述。影響因素包括：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。堿性磷酸酶

米氏常數(shù)的測(cè)定原理米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中的一個(gè)相當(dāng)重要的常數(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，可理解并掌握利用實(shí)驗(yàn)求出Km的方法。在酶促反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度、pH及酶濃度恒定時(shí)，底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。米氏方程式：反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式

。[S]：底物濃度V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速率Vmax：最大反應(yīng)速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──VmaxV[S]KmVmax/2Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。酶底物復(fù)合物E+SE+PES(過(guò)渡態(tài))

Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)雙倒數(shù)作圖法-1/Km

1/Vmax1/[S]1/V本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶（AKP）為材料，用磷酸苯二鈉為其底物。AKP催化磷酸苯二鈉水解產(chǎn)生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，可生成紅色的醌衍生物。根據(jù)紅色的深淺可測(cè)出酚的含量，進(jìn)而算出相應(yīng)的酶活性(V)。再根據(jù)Lineweaver—Burk法作圖，計(jì)算其Km值。操作

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

1)取試管8支，按下表操作(應(yīng)特別注意準(zhǔn)確吸取底物溶液及酶液)：加入酶液立即計(jì)時(shí)，混勻后置37℃水浴準(zhǔn)確保溫15min。2)保溫結(jié)束，各管立即加入堿性溶液1ml以終止反應(yīng)。3)各管中分別加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％鐵氰化鉀2ml，混勻，放置l0min，以第8管調(diào)零點(diǎn)，于510nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定各管吸光度。酶促反應(yīng)速度計(jì)算酶促反應(yīng)速度以每15分鐘所產(chǎn)生酚的微克數(shù)(μg

／15min)來(lái)表示。根據(jù)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線查出各管的酚含量，即各管在不同底物濃度下的反應(yīng)速度。本實(shí)驗(yàn)不制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，而以1／[S]對(duì)1／A作圖，因各管吸光度與其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反應(yīng)速度。注意事項(xiàng)(1)底物濃度和酶濃度都對(duì)酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生巨大影響，故該實(shí)驗(yàn)的成功與否，在很大程度上取決于各種試劑(特別是底物溶液和酶液)吸液量的準(zhǔn)確性。(2)

加入酶液立即計(jì)時(shí)，混勻后置37℃水浴準(zhǔn)確保溫15min。

實(shí)驗(yàn)記錄堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定日期、室溫A

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0.000實(shí)驗(yàn)報(bào)告

堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定日期室溫一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、數(shù)據(jù)處理（一）繪制米氏方程式曲線（二）繪制雙倒數(shù)曲線四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：AKP的Km=五、實(shí)驗(yàn)討論（一）繪制米氏方程式曲線A

123456780.000Smmol/L234568160ＶVmax[S]

Km+[S]＝──AKP米氏方程式曲線圖A[S]（二）繪制雙倒數(shù)曲線1/A

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