原位分子雜交組織化學(xué)

原位分子雜交組織化學(xué)InSituHybridizationHistochemistry(ISHH)一、概念

用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待測的核酸按堿基配對的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后再用與標(biāo)記物對應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在核酸原有位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。二、原位雜交的基本原理三、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用1.細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位；2.癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的研究；

3.病原微生物檢測；4.基因在染色體上的定位；5.檢測染色體的變化；6.分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究。四、核酸探針的種類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同

DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針、寡核苷酸探針根據(jù)探針的標(biāo)記方法不同放射性探針：32P、3H、35S

非放射性探針：生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記熒光標(biāo)記DNA探針1.克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限增殖，制備簡便。2.不易降解。標(biāo)記的方法較成熟多樣（切口平移等）cDNA

探針1.互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。2.逆轉(zhuǎn)錄合成，不含內(nèi)含子序列，適宜基因表達(dá)的檢測。單鏈比雙鏈靈敏度高，且不需變性，使能與靶mRNA結(jié)合的探針濃度提高。cRNA探針單鏈分子，雜交反應(yīng)效率高?？煽刂妻D(zhuǎn)錄方向，得到同義RNA探針（與mRNA同序列），或反義RNA探針（cRNA，與mRNA互補(bǔ)）?？蓹z測DNA和mRNA，還可觀察基因的轉(zhuǎn)錄狀況。易于降解，標(biāo)記方法復(fù)雜。寡核苷酸探針鏈短、分子量小、序列復(fù)雜度低，雜交時間比克隆探針短?？勺R別靶序列中一個堿基的變化，故成套探針用于堿基點(diǎn)突變的檢測。一次可大量合成，價(jià)格低廉，易于標(biāo)記。缺點(diǎn)：與克隆探針比較，特異性差，雜交信號弱。設(shè)計(jì)篩選寡核苷酸探針的原則長30-50bp，長探針則雜交時間長，短則特異性差。堿基成分：G＋C含量為40%-60%。探針分子內(nèi)不能有互補(bǔ)區(qū)。探針種類優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)cDNA

1.制備簡單2.放射比活性高3.信號特異性強(qiáng)

4.雜交體較穩(wěn)定1.變性后才能使用2.要基因克隆3.組織穿透力差4.易于退火cRNA

1.信號特異性強(qiáng)2.不需變性3.雜交后可用RNase除去未雜交的探針4.雜交體非常穩(wěn)定5.不會退火

1.易被Rnase降解2.易吸附于器皿上3.組織穿透力差4.需做亞克隆寡聚核苷酸1.易制備2.使用方便3.組織穿透力強(qiáng)4.不需做克隆

5.不會退火6.只要知道氨基酸順序便可制備探針1.需核酸合成儀2.需明確mRNA順序3.單堿基錯誤將影響雜交4.雜交體不太穩(wěn)定

五.探針標(biāo)記

探針的標(biāo)記物分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記兩大類：放射性標(biāo)記物一般為125I、35S或32P；非放射性標(biāo)記有生物素或地高辛的間接標(biāo)記，也有FITC或者羅丹明對探針分子的直接標(biāo)記。探針標(biāo)記方法比較敏感性：放射性探針＞地高辛探針＞生物素探針對人危害性：放射性探針、生物素探針放射性探針受半衰期限制，不可長期保存。生物素探針受內(nèi)源性生物素影響，可致假陽性；地高辛探針則顯色復(fù)雜。

探針標(biāo)記方法

探針標(biāo)記方法很多，大致分為：引入法和化學(xué)修飾法。*引入法：運(yùn)用標(biāo)記好的核苷酸來合成探針；*化學(xué)修飾法：采用化學(xué)方法將標(biāo)記物摻入已合成的探針分子中去，或改變探針原有的結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生特定的化學(xué)基團(tuán)。引入法較化學(xué)修飾法更常用，按其整合的方法不同，引入法分為：*缺口平移法*隨機(jī)引物法*末端標(biāo)記法*PCR擴(kuò)增標(biāo)記法*RNA體外轉(zhuǎn)錄法缺口平移法

原理：利用DNA酶I在雙鏈DNA的各股單鏈的不同位置上造成隨機(jī)切口，再利用大腸桿菌DNA聚合酶進(jìn)行5’→3’修復(fù)，將已標(biāo)記dNTP摻入到新合成的DNA鏈中。隨機(jī)引物法原理：將長6個核苷酸的寡核苷酸片段（隨機(jī)引物）與單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合（退火），在引物的3‘羥基末端逐個加上核苷酸直至下一個引物，即形成標(biāo)記的DNA探針。

末端標(biāo)記法

原理：將標(biāo)記物導(dǎo)入線性DNA或RNA的5’端或3’端的一類標(biāo)記方法。主要分為：5’末端標(biāo)記法，3’末端標(biāo)記法，T4聚合酶替代法。五、ISHH基本程序（以檢測組織細(xì)胞內(nèi)的mRNA為例）(一）雜交前處理玻片預(yù)處理（滅活Rnase)切片處理（增強(qiáng)組織通透性和探針穿透性）

1.玻片預(yù)處理（滅活Rnase)

玻片置于熱肥皂水浸泡4小時以上自來水清洗干凈置于酸缸中浸泡過夜清水洗凈烘干烘箱溫度最好在150℃或以上烤干4小時以上。以去除任何RNA酶.蓋玻片在有條件時最好用硅化處理,錫箔紙包裹無塵存放.

粘附劑:常用的粘附劑多聚賴氨酸溶液。

2.切片處理：增強(qiáng)組織通透性和探針穿透性1）充分脫蠟2）防止探針與組織中堿性蛋白靜電結(jié)合，降低背景稀酸處理（0.2mol/lHCL10min）乙酰化（0.25%乙酸酐10min）3）去污劑：增加組織通透性，利于探針進(jìn)入0.01%-0.3%TritonX-10015min4）酶消化：使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露

蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、胃蛋白酶1ug/ml蛋白酶K，37℃，15-30min

5）雜交緩沖液孵育：阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)

3.防止RNA酶的污染

由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃皿上均可能有RNA酶,為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套.所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫(160℃)烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的.要破壞RNA酶,其最低溫度必需在150℃左右.

（二）雜交反應(yīng)：

將雜交液滴于經(jīng)預(yù)雜交處理的組織細(xì)胞切片上，加蓋硅化的蓋玻片，按所要求的溫度進(jìn)行的孵化。

雜交液

1）一定濃度的探針2）高濃度Na+:使雜交率增加，減少靜電結(jié)合3）硫酸葡聚糖：10%硫酸葡聚糖，形成探針混合液基質(zhì)，對DNA有濃縮作用，可提高雜交的反應(yīng)速度10倍以上，但不影響探針的洗脫強(qiáng)度；雜交時常用濃度為5%～10%，但濃度高時會使溶液的粘度增大，不利雜交探針的滲透。4）牛血清白蛋白、載體DNA或RNA：阻斷非特異性結(jié)合，降低背景。

探針濃度：以最低濃度達(dá)到與靶核酸的最大飽和結(jié)合度0.5-5.0ug/ml，10-20ul/片雜交時間：

一般為16~20小時雜交嚴(yán)格度：

反應(yīng)體系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸順序形成雜交復(fù)合物的條件。低雜交溫度、低甲酰胺的濃度、高離子強(qiáng)度條件下，嚴(yán)格度低，反之嚴(yán)格度高。嚴(yán)格度愈高，雜交反應(yīng)特異性愈強(qiáng)，但敏感性愈低。

(三）雜交后處理

目的：除去未參與雜交體形成的過余探針，除去探針與組織標(biāo)本之間的非特異性結(jié)合，降低背景，有利于信號的檢測。鹽溶液洗滌：鹽濃度由高至低溫度由低至高高濃度的鹽可減少探針與組織標(biāo)本間的靜電結(jié)合。洗滌過程中至少有一次高嚴(yán)格度條件下的洗滌，即低鹽、高溫、高甲酰胺

(四）雜交顯示

放射自顯影酶檢測系統(tǒng)（HRP、AP）

(五）對照實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判斷

組織對照、探針對照、雜交反應(yīng)對照、檢測