生物信息學(xué)PCR引物設(shè)計(jì)

常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院涂毅主要內(nèi)容一、PCR及引物設(shè)計(jì)的一般原則二、常用的引物設(shè)計(jì)軟件三、引物設(shè)計(jì)流程四、實(shí)例分析五、使用Primer–BLAST工具快速設(shè)計(jì)引物一、PCR及引物設(shè)計(jì)的一般原則聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，表現(xiàn)為：擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。具體因素一般原則1.引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來說引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn).Tm值的計(jì)算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過9），而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

二、常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer-BLAST（在線服務(wù)）*三、引物設(shè)計(jì)流程序列查找和下載序列同源性比較引物設(shè)計(jì)與篩選引物加工與修飾引物評(píng)價(jià)分析引物二次篩選引物最終評(píng)估擴(kuò)增基因：BPMVRNA2鏈上的CP基因片段。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模焊鶕?jù)RNA2中的CP基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，然后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，以此來檢測(cè)BPMV在樣品材料中的存在情況。四、

實(shí)例分析研究背景：菜豆莢斑駁病毒（BPMV）

具有大小分別為41kDa和22kDa的兩種外殼蛋白（coatprotein，cp），由RNA2鏈編碼，CP基因序列相對(duì)保守，可對(duì)此進(jìn)行PCR擴(kuò)增來檢測(cè)BPMV?！蠲嘎?lián)免疫方法檢測(cè)的是表面指標(biāo)，只能提供間接證據(jù)，而PCR技術(shù)直接檢測(cè)的是核酸，適用于病毒密度很低的臨床標(biāo)本檢測(cè)軟件資源BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)站點(diǎn):

/BLAST/PrimerPrimier、Oligo下載：

/q2.htmlDNAMAN下載/?Go=Show::List&ID=125704.1在NCBI上查找BPMV的相關(guān)序列4.2BLAST同源序列（相似性序列）查找登陸ncbi的blast主頁(yè)搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)使用核苷酸查詢搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)用蛋白查詢搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用一個(gè)翻譯的核苷酸查詢搜索翻譯的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)使用的一種蛋白質(zhì)查詢搜索翻譯核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，使用一個(gè)翻譯的核苷酸查詢會(huì)彈出一個(gè)頁(yè)面有10秒鐘的更新提示圖形示意結(jié)果24匹配序列描述帶有g(shù)enbank的鏈接，點(diǎn)擊可以進(jìn)入相應(yīng)的genbank序列匹配情況，分值，e值具體匹配情況將四條序列保存在一個(gè)txt文檔中4.3DNAMAN同源序列比對(duì)獲取保守區(qū)域4.4PrimerPrimier引物設(shè)計(jì)與篩選4.5Oligo引物的評(píng)價(jià)分析Ctrl+O打開序列顯示引物的位置和長(zhǎng)度選擇的引物左右拖動(dòng)到引物的位置點(diǎn)擊Change–CurrentOligoLength，更改引物的長(zhǎng)度（默認(rèn)為21）移動(dòng)這個(gè)標(biāo)尺到引物起始的地方此處會(huì)顯示你選擇的引物的位置，可通過點(diǎn)擊下面的標(biāo)尺進(jìn)行調(diào)整引物的Tm值在72℃左右最佳；合理的Tm值應(yīng)在60~75℃，退火溫度比Tm低5℃；上下游引物的Tm差不應(yīng)超過5℃。GC%應(yīng)在40~60%可見此對(duì)引物的Tm值不符合要求，可考慮在5’端加幾個(gè)G或C，再做分析。找到上下游引物的位置后，點(diǎn)擊Analyze–PCR使用Oligo7自帶的引物設(shè)計(jì)功能搜索引物點(diǎn)擊Search–forPrimers&Probes使用默認(rèn)參數(shù)雙擊第一條結(jié)果這是對(duì)此引物的PCR反應(yīng)的歸納，最具有參考價(jià)值。而且沒有Comments，說明這個(gè)結(jié)果可以被接受。Oligo的引物搜索結(jié)果先檢查各條結(jié)果的產(chǎn)物序列是否位于保守區(qū)！切換到Sequence窗口，中間一個(gè)框顯示了選擇的正反引物的位置和長(zhǎng)度，點(diǎn)擊i標(biāo)志3’ΔG的絕對(duì)值不要超過9，否則會(huì)在錯(cuò)配點(diǎn)形成雙鏈接下來進(jìn)行引物具體分析。點(diǎn)擊Analyze分析二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)點(diǎn)擊Analyze–DuplexFormation–ForwardPrimer發(fā)夾結(jié)構(gòu)要求ΔG小于4.5，配對(duì)堿基對(duì)不超過3上游引物間形成二聚體要求ΔG小于4.5，配對(duì)堿基對(duì)不超過3下游引物的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析堿基組成和Tm值點(diǎn)擊Analyze–Composition&Tm–ForwardPrimer不同算法得到的Tm值要在50~70℃GC%要在40%~60%下游引物的Tm值和GC%，與上游引物不能相差太大。分析錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)點(diǎn)擊Analyze–FalsePrimingSites–ForwardPrimer一般，錯(cuò)誤引發(fā)效率應(yīng)在100以下。若正確引發(fā)效率大于400，該值可適當(dāng)放寬。這里是可以接受的。正確引發(fā)效率為437（超過閾值）下游引物的錯(cuò)誤引發(fā)效率通過上述分析，引物評(píng)價(jià)完成。將結(jié)果保存。將篩選出來的引物逐個(gè)在Oligo7軟件中評(píng)估。點(diǎn)擊Edit–ForwardPrimer，編輯上游引物。可以在5’端前添加G或C以提高Tm值，或加入酶切位點(diǎn)，然后再做Analyze。決定后，將該引物選中，Ctrl+C、Ctrl+V粘貼：GCCAGTTCTGATATTTACACC同理，編輯并保存下游引物下游引物：AATGAAATCCAGTACGCTTC，方向默認(rèn)是5’→3’4.6引物的二次篩選引物確定后，要在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。注意：該病毒基因組中CP基因之外的其它基因是否也能和引物匹配；該病毒寄主（菜豆）基因組是否有和引物匹配的片段（因?yàn)橛袝r(shí)病毒存在于寄主中，因而擴(kuò)增的模板就包含兩個(gè)物種的基因組）。如果是，就要棄掉這樣的引物，以防止PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。1、進(jìn)入網(wǎng)頁(yè)：/BLAST/

2、點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)3、進(jìn)入blastn界面GCCAGTTCTGATATTTACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATGAAATCCAGTACGCTTC（1）輸入上下游引物序列，都從5→3，中間用20個(gè)以上的N隔開Others（2）在Database選中Others數(shù)據(jù)庫(kù)SomewhatsimilarsequencesShowresultsinanewwindow打鉤AlgorithmparametersExpectthresholdWordsizeExpect值越高，匹配到的結(jié)果序列越多Word-size，字長(zhǎng)。BLAST的字長(zhǎng)缺省值為11，即BLASTN將掃描數(shù)據(jù)庫(kù)，直到發(fā)現(xiàn)那些與未知序列的11個(gè)連續(xù)堿基完全匹配的11個(gè)連續(xù)堿基長(zhǎng)度片段為止。降低字長(zhǎng)能增加搜索到的結(jié)果。基因找到了目的基因，可見引物的正確性沒有問題。五、使用Primer–BLAST工具快速設(shè)計(jì)引物Primer–BLAST為NCBI開發(fā)的一款引物在線設(shè)計(jì)工具，將引物設(shè)計(jì)和序列比對(duì)一步完成，從而快速篩選獲得的引物。上傳模板序列如果你已經(jīng)設(shè)計(jì)好了引物，可以來驗(yàn)證引物的好壞。這里是引物設(shè)計(jì)，所以不用填對(duì)上傳的模板序列返回10對(duì)引物設(shè)定Tm值選擇引物比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)和物種搜索的結(jié)果對(duì)每對(duì)引物進(jìn)行分析后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的引物用于合成，然后進(jìn)行PCR。注意：在選擇數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，BLAST提供了4種數(shù)據(jù)庫(kù)：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)是經(jīng)過專家注釋的數(shù)據(jù)，這樣可以給出更準(zhǔn)確的結(jié)果。一些Tips

1，在任何時(shí)候都要優(yōu)先使用參考序列的Gi號(hào)或Accession號(hào)（盡量不要Fasta格式的序列）。另外，確保你的序列是最新版本的（在填A(yù)ccessionNumber時(shí)后面不加版本號(hào)就會(huì)自動(dòng)拿最新的序列）2，就算你對(duì)整個(gè)序列的某部分感興趣（如某條染色體上的某個(gè)區(qū)域），你也應(yīng)該優(yōu)化使用Gi號(hào)或Accession號(hào)（Primer-BLAST有參數(shù)可以設(shè)置設(shè)計(jì)引物的范圍，”Form-To”）。因?yàn)橛肎i號(hào)或Accession號(hào)，NCBI會(huì)自動(dòng)讀取該序列的一些注釋數(shù)據(jù)，對(duì)引物的設(shè)計(jì)更加有利。3，盡量使用沒有冗除的數(shù)據(jù)庫(kù)（如refseq_rna或genomedatabase），nr數(shù)據(jù)庫(kù)包括了太多的冗除的序列，會(huì)干擾引物的設(shè)計(jì)。4，請(qǐng)指定一個(gè)或幾個(gè)PCR擴(kuò)增的目標(biāo)物種。如果不指定在所有的物種搜索，將會(huì)使程序變得很慢，引物的結(jié)果也會(huì)受其它不相關(guān)的物種影響。小結(jié)一、引物設(shè)計(jì)流程（1）序列查找和下載GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（2）同源性比較獲取高度保守的序列，PCR引物應(yīng)位于其中（3）引物設(shè)計(jì)與篩選PrimerPremier、Oligo、Primer-BLAST小結(jié)一、引物設(shè)計(jì)流程（4）引物加工與修飾酶切位點(diǎn)、特異性標(biāo)簽（5）引物評(píng)價(jià)分析Oligo（6）引物二次篩選BLAST（7）進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)做最終評(píng)估小結(jié)二、引物設(shè)計(jì)原則（1）引物長(zhǎng)度18~27bp（2）引物特異性引物應(yīng)位于保守區(qū)內(nèi)（做模板同源性比對(duì)）（3）引物堿基分布3’端避免出現(xiàn)GGG、CCC，末端避免出現(xiàn)A小結(jié)二、引物設(shè)計(jì)原則（4）引