計算藥學第5章(第1,2,3次課的課件,第1,2,3次課講到第73張幻燈片了,計算藥物分析)

第5章分析測試中的質量保證1、質量管理體系和質量保證

2、對照品和標準物質

3、分析采樣理論4、分析方法的驗證5、雜質分析的指導原則（其中2、4節(jié)為重點小節(jié)）.藥品質量的重要性藥物作為一種特殊的商品，其質量直接關系到人民的生命安全和健康水平相關新聞數(shù)據(jù)顯示，全國每年有20萬人死于藥品不良反應齊二藥的亮甲菌素注射液事件安徽華源的“欣弗”事件花樣年華葬于“欣弗”之手5.1質量管理體系和質量保證⑴質量保證和質量控制質量保證是個綜合過程，涉及到人員、技術、管理等各個方面。國際上經(jīng)過數(shù)百年工業(yè)大生產(chǎn)及其質量管理的實踐，從早期的個人檢查把關，到50年代的統(tǒng)計質量管理和近年來的全面質量管理階段，在各個行業(yè)中已經(jīng)逐步形成了比較完整和成熟的質量管理體系。GMP、GSP、GCP、GLP等。藥品的生產(chǎn)、貯存、運輸、銷售和使用都必須嚴格按照這些法令性文件進行全面質量控制和質量保證的科學管理?？刂茍D是經(jīng)常使用的質量評定技術之一。最常用的控制圖是用同一標準方法對同一標準樣品測試20次以上，求出其平均值和標準偏差s,在坐標紙上以為x中線，以±2s為警戒線，以±3s為控制限，依次標繪實驗點并連成線，即得到控制圖。得到控制圖以后，日常分析中用標準物質測試的結果如落到控制限以外，就說明-樣品測試無效，應找出原因，并采取措施糾正后重新用標準物質校正。5.2對照品和標準物質2、對照品和標準物質不確定度的發(fā)展不確定度在國際的發(fā)展1927年海森堡仔細分析了微觀物理體系的實際行為，提出了指定和測量這類變量所能達到的準確度存在一個基本極限，稱之為不確定度關系1963年美國國家標準局提出定量表示不確定度的建議1980年國際計量局作出《實驗不確定度的規(guī)定建議書INC-1》向各國推薦了不確定度的表達原則，使不確定度在計算上有了共同基礎，也使各種計量不確定度的說明有了共同語言，對不確定度的表示方法取得了國際的同一1993年由ISO與BIPM，IEC，IFCC，IUPAC，IUPAP，OIML合作出版《測量不確定度表示導則》（GUM），這是一個應用性指南，在不確定度的術語定義、概念、評定方法和報告時的表達方式上都做出了更進一步的統(tǒng)一規(guī)定不確定度在我國的發(fā)展1986年中國計量科學研究院發(fā)出不確定度應用方法的通知，規(guī)定在基準標準研究中，在測量和檢定工作中，應采用不確定度作為誤差的數(shù)字指標。1999年國家計量技術監(jiān)督局發(fā)布了技術規(guī)范JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》，作為國家標準公布施行

誤差與測量不確定度二者既有聯(lián)系，又有著本質的區(qū)別。誤差理論是測量不確定度基礎，測量不確定度是經(jīng)典的誤差理論發(fā)展和完善的產(chǎn)物。誤差是客觀存在的測量結果對被測量真值的偏差，是無法準確得到的，測量不確定度與人們對被測量的認識程度有關，是由人們經(jīng)過分析和評定得到的，可以對測量結果作出定量評定。有可能測量結果的誤差很小，但由于認識不足，而認為不確定度很大；也有可能誤差較大，由于分析估計不足，相反給出偏小的不確定度

不確定度與誤差測量誤差測量不確定度定義反映測量結果偏離真值的程度反映測量結果的分散性程度來源隨機效應和系統(tǒng)效應隨機性和模糊性表示符號非正即負恒為正值獲得途徑通過約定真值獲得估計值由實驗、資料、經(jīng)驗評定分類隨機誤差、系統(tǒng)誤差、粗大誤差A類評定、B類評定合成方法各誤差分量的代數(shù)和平方和之后開根結果修正可用系統(tǒng)誤差估計值修正結果不能對結果進行修正結果說明屬于給定的測量結果屬于合理賦予被測量的任意值自由度無作為不確定度評定是否可靠的指標置信概率無需按置信概率給出置信區(qū)間測量不確定度的重要性已經(jīng)得到廣泛的認識，一個完整的定量分析結果應該包含不確定度信息，它是定量分析結果的重要組成部分，是評價分析結果可信度的重要參數(shù)。此外，測量方法的不確定度在方法學研究等方面也能提供有益的指導，如提供分析過程主要誤差的來源信息、解決方案等。化學測量不僅要給出測量過程中所使用的各種參考標準的不確定度，而且要給出測量結果的不確定度

藥品檢驗工作中的作用對照品及標準品數(shù)據(jù)的標注物理化學常數(shù)測定的結果（吸光系數(shù)、折光率等）樣品測定結果的表示中央藥品檢驗所做的工作。測量不確定度的估算過程開始說明被測量

識別不確定度源

組合現(xiàn)有數(shù)據(jù)包含的不確定度源進行簡化

量化通過組合的組分

量化剩下的組分

將不確定度組分轉化為標準偏差

復核

計算合成不確定度

計算擴展不確定度

結束標準不確定度的A類評定貝塞爾公式：其正平方根就表示的分散性。稱為樣本標準差或實驗標準差。測量結果的標準不確定度為計算合成標準不確定度符號

說明

x標準不確定度u(x)相對標準不確定度u(x)/xm水m樣終點f水的重量樣品的重量終點的偏差溫度/濕度的校正因子10mg87.5mg100%10.0960.0960.130.00420.00960.00110.00130.0042計算擴展不確定度Uc按95％置信概率，包含因子κ采用2：最終結果表示為：該樣品的水分含量為：（0.09±0.002%）5.3分析采樣理論

⑴采樣的重要性采樣是分析測試工作的笫一步。分析的過程是通過樣本研究總體性質的過程，測試結果的誤差和采樣誤差密切相關。當分析測量的不確定度降低到樣本不確定度的1／3或者更少時，沒有必要再進一步提高分析測試的精密度。

根據(jù)誤差傳遞理論，結果誤差要取決于精密度最差的單次測量度，僅僅提高單次測量的精密度常常是沒有意義的。但人們常?；ù罅庋芯咳绾胃纳品治龇椒ǖ木芏?，而忽略了采樣方法的正確性。⑵采樣方法

采樣方法應選取盡可能少的樣本而使獲結果最大程度地反映被研究總體的特征。對于不同類型的分析對象，取樣的具體操作一般都有行業(yè)規(guī)定的方法。如藥品的分析取樣，在國家藥典附錄和《藥品生產(chǎn)管理規(guī)范實施指南》中都有明確的規(guī)定。數(shù)理統(tǒng)計方法是正確采樣的理論依據(jù)。5.4分析方法的驗證

5.4.1概述為了保證分析測試結果的可靠性和準確性，必須要有分析方法的標準化和規(guī)范化。世界各國和一些國際組織都十分重視分析方法的標準化和規(guī)范化。如國際標準化組織（ＩＳＯ）下設近二百個技術委員會，每年都頒布若干新的標準方法，每五年都對已經(jīng)有的標準方法修訂一次；美國官方化學家協(xié)會（ＡＯＡＣ）已經(jīng)研究并頒布了數(shù)千種官方標準分析方法；由各國政府組織的藥典委員會頒布收載的醫(yī)藥品規(guī)格標準即藥典是具有法律效力的藥品國家標準。對標準方法以及科研工作中建立的方法都應有一定的方法和數(shù)據(jù)證實其可靠性和可行性。這是所建立的方法能被同行重復和驗證，發(fā)表以后能被他人應用，得到普及，具有實用價值的重要基礎。為了保證分析測試結果的可靠性和準確性，必須對建立的方法進行系統(tǒng)科學的驗證(validation)?！椒▽W研究在醫(yī)藥行業(yè),最早提出對藥品檢驗分析方法進行驗證的是美國藥典。美國藥典從1990年版起增加了一個附錄“法定方法的驗證(Validationofcompendialmethods)”。按照該項附錄的規(guī)定，任何一個新方法的建立或改進，都必須有足夠的理由說明其必需性，和有足夠的資料證明其可靠性和可行性，并經(jīng)過標準程序的證實，其目的就是把藥品檢驗方法的建立和改進標準化，以保證方法的準確可靠。

新藥質量研究的有關規(guī)定

現(xiàn)行版藥典及ICH

有關文件ICHfilesforquality(Q2，Q3）藥典附錄:藥品質量標準分析方法驗證3.藥典附錄:藥品穩(wěn)定性試驗指導原則4.藥典附錄:雜質分析指導原則5.SFDA:藥品注冊管理辦法(2002-437，號文+附件1、2）6.SFDA:原料藥質量研究及質量標準制定指導原則7.SFDA:制劑質量研究及質量標準制定指導原則

5.4.2人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）

人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會議

InternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse(1991年建立)籌備:國際協(xié)調小組（PDG）：

1989年建立，美國、歐洲、日本

1．ICH成立的背景

不同國家，對新藥上市前要進行審批的實現(xiàn)時間是不同的。美國在30年代發(fā)生了磺胺醑劑事件，F(xiàn)DA開始對上市藥品進行審批；日本政府在50年代才開始對上市藥品進行注冊；歐盟在60年代發(fā)生反應停（Thalidomide）慘案后，才認識到新的一代合成藥既有療效作用，已存在潛在的風險性。于是，許多國家在六、七十年代分別制定了產(chǎn)品注冊的法規(guī)、條例和指導原則。為了嚴格管理藥品,必須對藥品的研制、開發(fā)、生產(chǎn)、銷售、進品等進行審批，形成了藥品的注冊制度。隨著制藥工業(yè)趨向國際化并尋找新的全球市場，各國藥品注冊的技術要求不同，以至使制藥行業(yè)要在國際市場銷售一個藥品，需要長時間和昂貴的多次重復試驗和重復申報，導致新藥研究和開發(fā)的費用逐年提高，醫(yī)療費用也逐年上升。因此，為了降低藥價并使新藥能早日用于治療病人，各國政府紛紛將“新藥申報技術要求的合理化和一致化的問題”提到議事日程上來了。不同國家對藥品注冊要求各不相同，這不僅不利于病人在藥品的安全性、有效性和質量方面得到科學的保證及國際技術和貿(mào)易交流，同時也造成制藥工業(yè)和科研、生產(chǎn)部門人力、物力的浪費，不利于人類醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。由美國、日本和歐盟三方的政府藥品注冊部門和制藥行業(yè)在1990年發(fā)起建立ICH美、日、歐開始了雙邊對話，研討協(xié)調的可能性，直至1989年在巴黎召開的國家藥品管理當局會議（ICDRA）后，才開始制定具體實施計劃。此后三方政府注冊部門與國際制藥工業(yè)協(xié)會聯(lián)合會（IFPMA）聯(lián)系，討論由注冊部門和工業(yè)部門共同發(fā)起國際協(xié)調會議可能性。1990年4月歐洲制藥工業(yè)聯(lián)合會（EFPIA）在布魯塞爾召開由三方注冊部門和工業(yè)部門參加的國際會議，討論了ICH目標和任務，成立了ICH指導委員會。會議決定每兩年召開一次ICH會議，由三方輪流主辦。第一次指導委員會協(xié)調了選題，一致認為應以安全性、質量和有效性三個方面制定的技術要求作為藥品能否批準上市的基礎，并決定起草文件。同時，每個文件成立了專家工作組（EWG），討論科學技術問題。后來，隨著工作的深入開展，認為電子通訊和術語的統(tǒng)一，應作為互讀文件的基礎。因此，增加了“綜合學科”，并成立了子課題。2．概況及組織機構

ICH是由歐盟、美國和日本三方的藥品注冊部門和生產(chǎn)部門組成，六個參加單位分別為：

---歐盟，EuropeanUnion(EU)

---歐洲制藥工業(yè)協(xié)會聯(lián)合會，EuropeanFederationofPharmaceuticalIndustriesAssociations(EFPIA)

---日本厚生省，MinistryofHealthandWelfare，Japan(MHW)

---日本制藥工業(yè)協(xié)會，JapanPharmaceuticalManufacturersAssociation(JPMA)

---美國食品與藥品管理局，USFoodandDrugAdministration(FDA)

---美國藥物研究和生產(chǎn)聯(lián)合會，PharmaceuticalResearchandManufacturersofAmerica(PRMA)

世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO）、歐洲自由貿(mào)易區(qū)（EuropeanFreeTradeArea,EFTA）和加拿大衛(wèi)生保健局（CanadianHealthProtectionBranch,CHPB）作為觀察員；國際制藥工業(yè)協(xié)會聯(lián)合會（InternationalFederationofPharmaceuticalManufacturersAssociations,IFPMA）作為制藥工業(yè)的保護傘組織參加協(xié)調會。ICH秘書處設在日內(nèi)瓦IFPMA總部。ICH由指導委員會、專家工作組和秘書處組成：

（1）指導委員會（theStreeringCommittee,SC）

指導委員會共有14名成員，由六個參加單位和IFPMA各派兩名代表組成。指導委員會主要領導ICH會議并協(xié)調工作進展。每年召開2-3次會議，分別由主辦國管理部門的代表主持會議，三個觀察員組織可分別排1名代表列席指導委員會會議。指導委員會對2和4兩個關鍵階段進行討論，做出決定。

（2）專家工作組（ExpertWorkingGroups,EWG）專家工作組是指導委員會的技術顧問，六個主辦單位對每個起草文件的專題派若干專家參加，其中1名任專題組長。

(3）秘書處秘書處設在日內(nèi)瓦IFPMA總部。主要負責指導委員會及專家工作組會議的準備工作和有關文件的起草，并負責與各組的協(xié)調員聯(lián)系，以保證將討論的文件按時發(fā)送到有關人員。藥品質量控制規(guī)范文件通用方法賦形劑（12個品種）標準的統(tǒng)一減少動物試驗加強體內(nèi)等效性研究注重提高維生素等營養(yǎng)保健藥品的質量加強藥品安全保障(說明書的規(guī)范化等)新分析檢測技術的發(fā)展和應用3.ICH協(xié)調工作的原則及進展協(xié)調的專題共分四個類別：

---安全性（safety，包括藥理、毒理、藥代等試驗），以“S”表示，現(xiàn)已制定16個文件；---質量（Quality，包括穩(wěn)定性、驗證、雜質、規(guī)格等），以“Q”表示，現(xiàn)已制定12個文件；---有效性（Efficacy，包括臨床試驗中的設計、研究報告、GCP等），以“E”表示，現(xiàn)已制定14個文件；---綜合學科（Multidisciplinary，包括術語、管理等），以“M”表示，現(xiàn)已制定4個文件。

Quality

Safety

Efficacy

AnalyticalValidationImpuritiesStabilitytestsguidanceforsettingspecificationsfornewdrugsandproductsICH已就藥品安全性、質量、有效性等頒發(fā)了近50個文件，其中有關藥品的質量及穩(wěn)定性、標準方法驗證等內(nèi)容的文件以“Q”編號，和我們分析質量控制密切相關的主要是Q開頭的10余個文件；其中Q2A介紹了有關分析方法質量控制的術語，Q2B則介紹了方法學研究的具體要求和方法。目前，這兩個文件已成為國際公認的對醫(yī)藥品分析方法進行驗證的基本原則。5.4.3藥品質量標準分析方法驗證（中國藥典2000、2005年版附錄ⅩⅨA

）1、概述目的：證明方法的科學性和可行性， 符合相應檢測要求要求：按規(guī)定分析項目和驗證內(nèi)容設計和完成實驗過程和結果均應記載在藥品標準研究資料中

意義:規(guī)范化、科學性、通用性應用：驗證分析方法藥品質量標準起草。生產(chǎn)工藝或制劑處方變更時對原分析方法修訂。證明所采用的分析方法適合于相應的檢測要求規(guī)定了建立或改進方法必須按標準格式遞交報告；要求清楚地介紹建立或改進方法的目的、必要性及其特點，完整地敘述方法，列出所需的儀器、試劑藥品、操作步驟、注意事項、計算公式等；要求列出按標準程序對分析方法進行驗證的方法、數(shù)據(jù)和結論，以充分證實所建立分析方法的可靠性和可行性。2、需驗證的分析項目

⑴鑒別試驗；

⑵雜質定量或限度檢查；

⑶原料或制劑中有效成分含量測定；

⑷制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測定；⑸溶出度、釋放度等檢查中的溶出量等的測試方法。

3、驗證內(nèi)容準確度、精密度（重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性⑴準確度（accuracy）準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。

測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗法”和“加樣回收試驗法”。

回收試驗空白+已知量A的對照品（或標準品）測定，測定值為M

加樣回收試驗已準確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標準品）測定，測定值為M

數(shù)據(jù)要求規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結果評價，如制備高、中、低三個不同濃度樣品各測三次。①含量測定方法的準確度

原料藥可用已知純度的對照品或樣品進行測定，或用本法所得結果與已建立準確度的另一方法測定的結果進行比較。

制劑可用含己知量被測物的各組分混合物進行測定，即采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進行測定，或與另一個已建立準確度的方法比較結果。

中藥分析的準確度一般用加樣回收試驗衡量。中藥回收率一般要求在95～105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時，可要求在90～110%范圍內(nèi)。RSD一般在2%以內(nèi)。②雜質定量測定的準確度可向原料藥或制劑中加入已知量雜質進行測定。如果不能得到雜質或降解產(chǎn)物，可用本法測定結果與另一成熟的方法進行比較。

⑵精密度（precision）精密度是指在規(guī)定條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結果之間的接近程度。用偏差（d）、標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。允許誤差

容量分析（中和法、非水滴定法、銀量法、絡合滴定法、重氮化法、氧化還原法）≤0.3%；重量法≤0.5%；氧瓶燃燒法≤0.5%；凱氏定氮法≤1%;儀器分析≤3%①重復性(repeatability):在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測定結果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當作100%，至少測6次進行評價。②中間精密度同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備所得結果的精密度。③重現(xiàn)性(reproducibility)不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度。

數(shù)據(jù)要求：需報告RD，RSD和可信限。

⑶檢測限（limitofdetection，LOD）

檢測限系指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。屬限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

①非儀器分析目視法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。②信噪比法用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

（1）空白值＝0時；①測定背景10次以上，求出標準差σb。②將σb乘以三倍；③在工作曲線上求出3σb相對應的濃度Xb；即為方法的檢出值；

（2）空白值不等于0；①測定背景10次以上，求出標準差σb；②將σb乘以三倍；③在工作曲線上求出3σb相對應的濃度Xb；④將求得的對應濃度值加上空白值即得該方法的檢出限。

⑷定量限（1imitofquantitation，LOQ）指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求。

常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可按1984年國際純粹和應用化學聯(lián)合會(IVPAC)規(guī)定：用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經(jīng)試驗確定方法的實際測定下限。

儀器分析：通過測定一組空的樣品的背景信號后計算標準差S。以1OS來估算定量限度。（以定量限度制備的樣品來驗證）

非儀器分析：通過分析己知被測物濃度的樣品并確定一個樣品中被測物可被準確和精密測定出的最低濃度（量）。

注意問題檢測限、定量限和靈敏度的區(qū)別消除空白的局限性檢測限、定量限和靈敏度的區(qū)別

檢測限（detectionlimit）系指試樣中被測物能被檢測出的最低量；定量限（quantitationlimit）系指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具定量分析方法應達到的準確度和精密度。靈敏度(sensitivity)指的是分析信號隨組分含量變化的大小。一個分析方法的靈敏度常用校正曲線的斜率表示。校正曲線的斜率越大，單位濃度信號改變值越大，則方法靈敏度越高。嚴格來說，方法的靈敏度還和實驗點的分布有關，若實驗點和校準點的誤差即殘差的標準偏差為SE，則可按斜率／SE計算靈敏度。這里應注意靈敏度并不表示該方法最低檢測的量。離子選擇性電極法：

靈敏度和測定離子電荷有關；

檢測限則根據(jù)電極響應原理和響應膜的溶度積有關如電極法測定Ｃｌ-，反映靈敏度的響應斜率為５８ｍＶ／ｐＣｌ，檢測限約為２ｐｐｍＣｌ；而測定Ｃｄ＋２的響應斜率為２９ｍＶ／ｐＣｄ，檢測限約為0.005ｐｐｍ。若Ｃｌ-和Ｃｄ2+的校準曲線殘差的標準偏差基本相同，測定Ｃｌ-的靈敏度比測定Ｃｄ2+要高一倍，但檢測限要比測Ｃｄ2+差得多。

消除空白的局限性

分析空白往往對痕量分析的準確度、精密度和檢測下限起著決定性的作用。

分析空白廣義上實際包括樣品的玷污（正空白）、樣品的損失（負空白）和儀器噪音。在痕量和超痕量分析中，把樣品的玷污而引起的正空白稱為分析空白。分析空白對痕量分析結果的準確度起著決定性的作用，其影響程度和被測組分的含量水平直接有關。10±5ng空白值對測定結果準確度的影響若為常規(guī)分析，應該預先建立起分析空白的控制圖，扣除控制圖中的空白統(tǒng)計平均值；若未能建立控制圖，也應該扣除空白值，空白值應取對多個空白樣本測試的空白平均值。

⑸專屬性（specificity）選擇性（selectivity）的量度

指有其他成分（雜質、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時對供試物準確而專屬的測定能力，是指該法用于復雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量。

①鑒別反應

能與可能共存的物質或結構相似化合物區(qū)別，不含被分析的樣品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均應呈負反應。

問題:比較以下鑒別方法的專屬性

官能團化學鑒別;

高效液相色譜保留;

薄層液相色譜比移值;

紫外分光光度法;

紅外分光光度法

②含量測定和雜質測定

加有雜質、降解產(chǎn)物、有關化學物質或安慰劑成分的樣品。

破壞性試驗

粗品

所獲分析結果與未加前述成分之樣品的測試結果進行比較，兩組測試結果的差別即反映方法的專屬性。

色譜法和其他方法，應附代表性圖譜，亦說明專屬性。圖中應標明各組份的位置，色譜法中的分離度應符合要求

⑹線性（Linearity）

在設計的范圍內(nèi)，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。

線性通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率來表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要5個濃度考察線性，需提供相關系數(shù)，列出回歸方程和線性圖。

一般|γ|>0.99，可認為線性關系可符合常規(guī)分析要求。亦可由根據(jù)實驗數(shù)據(jù)擬合的方程y=axn+b中n的大小來確定；有文獻報道應用色譜定量方法時0.9<n<1.1可認為線性符合要求。⑺范圍（Range）：指達到一定精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。范圍的確定可因測定項目不同而有不同要求：含量測定和溶出度范圍為80%-120%；含量均勻度范圍為70%-130%；雜質測定應為被測雜質限度的50%-120%.圖5-6線性范圍的定義⑻耐用性穩(wěn)健性（robustness）和耐用性(ruggedness）一個好的分析方法應該不受環(huán)境等因素的變更而改變結果，即對各種外界因素不靈敏，在各種條件下，如在不同的實驗室、分析者、儀器型號、試劑批號、時間、溫度等條件下，都應得到一致的結果。如果對各種條件過于靈敏，在測試過程中就要嚴格控制這些條件，還提高了測試成本。這種考察試驗可包括兩方面的內(nèi)容:一是考察應用方法條件本身重復實驗對結果的影響，二是鑒別必須仔細控制的實驗條件和環(huán)境條件。例如，某高效液相色譜方法要求流動相為ｐＨ３緩沖液－甲醇（４：６），則建立方法時除了用該條件反復測試進行方差分析考察方法的精密度外，還可用析因試驗考察緩沖液ｐＨ２.９、３.１，甲醇５９、６１％等條件稍微變化下對實驗結果的影響，計算結果的統(tǒng)計誤差，考察ｐＨ值和甲醇％改變對結果的影響。對分析方法的驗證包括了穩(wěn)健性和耐用性試驗。穩(wěn)健性（robustness）系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。一般屬于實驗室內(nèi)方法研發(fā)和驗證環(huán)節(jié).例如，研究測定條件的改變包括流動相的組成、流動相的pH、濃度和色譜柱等的變化對結果的影響。經(jīng)常要通過系統(tǒng)的多因素兩水平實驗設計，如Plackett-Burman設計，對實驗結果的優(yōu)化指標予以考察。為提高效率，經(jīng)常采用不完全因子設計，對7因子設計需要8個實驗，11因子設計需要12個實驗。如果設計因子中包含分析者，儀器及實驗室，這種穩(wěn)健試驗也就是通常所說的耐用性試驗。耐用性(ruggedness）廣義來說是指同一樣品分析結果的再現(xiàn)性。耐用性的含義不僅要求方法的穩(wěn)定，而且包含了重復性，即當方法用于不同的分析者，實驗室以及儀器時所產(chǎn)生相近結果的能力。耐用性測定要在實驗室內(nèi)外分別進行。經(jīng)常要求一個分析方法被8個或更多的實驗室用于分析相同的樣品。耐用性試驗不僅僅是考察儀器系統(tǒng)的影響，而且還有樣品處理，樣品溶液制備和流動相配制等等多種影響因素，實驗結果要應用統(tǒng)計分析予以全面評估，能夠更加全面反映分析方法在不同實驗條件下性能的穩(wěn)定。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH值，不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱溫，流速等。氣相色譜法變動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，不同類型的擔體、柱溫，進樣口和檢測器溫度等。4、應用范圍4、應用范圍⑴鑒別試驗除專屬性、耐用性外，其它都不要求。⑵

雜質的限量檢查除專屬性、檢測限、耐用性外，其它都不要求。雜質的含量測定除檢測限外，其它都要求。⑶含量測定及溶出量測定除檢測限、定量限外，其它都要求。5、分析方法驗證的具體要求⑴容量分析法(即滴定分析法)用原料藥精制品(含量>99.5％)或對照品考察方法的精密度，相對標準差一般應不大于0.2％；進行回收率試驗，回收率一般在99.7～100.3％之間。

⑵UV法：用適當濃度的精制品進行測定，其RSD一般不大于1％。制劑的測定，回收率一般應在98％～102％之間。

線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點n＝5。用濃度c對A作線性回歸處理，得一直線方程，r應達到0.9999(n＝5)，方程的截距應近于零。⑶HPLC法：要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。線性范圍：用精制品配制一系列標準溶液，濃度點n應為5～7，用濃度c對峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，建立回歸方程，r應大于0.999，截距應趨于零。5.4.4分析方法驗證的統(tǒng)計分析

1.一元線性回歸分析的驗證對線性的評價(置信區(qū)間的計算)檢測限的計算對線性的評價用在定量范圍內(nèi)測得的工作曲線斜率的方差比較合理。根據(jù)n個實驗點的數(shù)據(jù)可分別計算殘差的標準差Sy/x、斜率的標準差Sb和截距的標準差Sa。增加重復測定次數(shù)m和實驗點數(shù)n，都能減小置信區(qū)間，提高測試準確度的可靠性。例5-4用熒光分光光度法測試標準熒光素水溶液的熒光強度數(shù)據(jù)如下：

c(μg／μ1)024681012熒光強度2.15.09.012.617.321.024.7(1)計算一元線性回歸方程，并計算截距和斜率的置信區(qū)間。(2)若測得3份樣品液熒光強度分別為2.9，13.5和23.O，試計算其含量和置信區(qū)間。(3)計算用本法測試的檢測限。2．分析方法的比較

在考察建立方法的準確度時，若能找到已有的標準方法單未獲得標準樣品。則可按已確認的標準方法平行測試作為標準值來對照檢查被檢驗的方法是否存在系統(tǒng)誤差，并進行比較。統(tǒng)計檢驗作圖法檢驗3.兩條回歸直線的比較在例行分析中應用比色法測試經(jīng)常需要對標準曲線是否需要校正進行檢查，對不同來源的標準溶液測得的工作曲線是否一致，有時也需進行比較。在應用標準加入法進行回收率試驗時要比較兩種回歸直線。所謂回歸直線的比較，就是檢驗回歸直線的兩個參數(shù)－斜率和截距是否一致。

4.標準加入法和基體效應

一般的校正曲線在背景干擾可以消除、測試信號不隨其它組分濃度改變時才可使用。當一個分析方法應用于不同樣品時，對于不同的測試對象常常需要考慮基體的影響?；w對待測組分的影響稱為基體效應，基體效應的大小對于選擇合適的分析方法有很大的影響。例5-5現(xiàn)欲測試未知溶液中的銅氨絡離子濃度，把未知樣品分成5份，分別加入不同量的銅氨絡離子，其濃度c和測得的吸收度結果如下：

c(mmol／L)O.03.06.09.O12.0A0.330.450.6lO.74O.85

【解】繪制校正曲線如圖5-8?；貧w線外推至x軸和原點間的距離，即在x軸上的截距表示原始樣品中的銅氨離子濃度，-O.007表示需要加入7mmol／L濃度的銅氨絡離子才能使吸收值的讀數(shù)為零；如果不用圖解法也可以用公式計算原始樣品中的濃度c：c=a／b(5-29)這里a是回歸線的截距，b是回歸線的斜率。本例中回歸線方程為y=O.3300+0.04433x，則c=O.3300／O.04433=7.444mmol／L,與外推圖解法的結果一致，且精密度較高。一般用標準物質測試的校正曲線僅能在基體效應可以忽略時才能使用。如果基體效應影響測定結果，但是影響不是很大時，可以用標準加入法來消除存在的基體效應。

在實際分析測試中，有時沒有和基體匹配的標準物質，此時如用純物質配制的標準溶液繪圖制校正曲線，而待測溶液測試時其中的基質將會引起較大的誤差。如顯影廢液中的含銀量，使用硝酸銀標準溶液繪制標準曲線進行計算將可能有較大的誤差。常用的解決方法是在顯影廢液中加入不同濃度已知量的銀鹽，作為標準系列繪制標準曲線。這種方法稱為標準加入法。!雜質是其中的一個關鍵因素！究竟有哪些因素在影響藥品的質量？雜質是影響藥品質量的重要因素中國藥典VS美國藥典中國應加強對制劑的質量控制!中國藥典(2005版)《藥品雜質分析指導原則》？國際人用注冊藥品協(xié)調會（ICH）Q3A、Q3B、Q3C雜質分析的指導原則雜質研究指導原則.pdf5.4.5附錄ⅩⅨF藥品雜質分析指導原則

藥品的特殊雜質（即有關物質）系指某一藥品中獨特存在的雜質，一般為在制備或貯存中根據(jù)其方法或其性質可能產(chǎn)生的某一雜質。這些雜質的檢查方法列入各藥品的檢查項下。常用的特殊雜質檢查方法除化學方法外包括各種儀器方法，如色譜法及分光光度法。近年來高效液相色譜法被越來越多地在特殊雜質的檢查項目中予以使用。有關物質檢查提高純度保證安全有效的重要指標有關物質分為

一般物質和特殊雜質產(chǎn)生原因：全過程

檢測方法：專屬性強、靈敏度高、重復性好；首選色譜法，更多使用聯(lián)用技術6.新藥報批中最容易出現(xiàn)的問題回收率試驗不符合要求；不做中間精密度試驗；檢測限計算錯誤；雜質測定用主成分研究。1．雜質的分類及其名稱按化學類別和特性，雜質可分為：有機雜質、無機雜質、有機揮發(fā)性雜質。按其來源，雜質可分為：有關物質（包括化學反應的前體、中間體、副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等）、其他雜質和外來物質等。按結構關系，雜質又可分為：其他甾體、其他生物堿、幾何異構體、光學異構體和聚合物等。按其毒性，雜質又可分為毒性雜質和普通雜質等。普通雜質即為在存在量下無顯著不良生物作用的雜質，而毒性雜質為具強烈不良生物作用的雜質。如磷酸可待因中的“嗎啡”，氯貝丁酯中的“對氯酚”，鹽酸苯海索中的“哌啶苯丙酮”，鹽酸林可霉素中的“林可霉素B”以及胰蛋白酶中的“糜蛋白酶”等。如果該雜質的化學名太長，又無通用的簡稱，可參考螺內(nèi)酯項下的“巰基化合物”、腎上腺素中的“酮體”、鹽酸地芬尼多中的“烯化合物”等，選用相宜的項目名稱。在質量標準起草說明中應寫明已明確雜質的結構式。(1)檢查對象明確為某一物質時，就以該雜質的化學名作為名稱，（2）檢查對象不能明確為某一單一物質而又僅知為某一類物質時，則其名稱可采用“其他甾體”、“其他生物堿”、“其他氨基酸”、“還原糖”、“脂肪酸”、“芳香第一胺”、“含氯化合物”、“有機溶劑殘留量”或“有關物質”等。（3）未知雜質，僅根據(jù)檢測方法選用項目名稱，如“雜質吸收度”“易氧化物”、“易炭化物”、“不揮發(fā)物”、“揮發(fā)性雜質”等。新原料藥和新制劑中的雜質，應按國家有關新藥申報要求進行研究，也可參考ICH（人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會）的文本Q3A（新原料藥中的雜質）和Q3B（新制劑中的雜質）進行研究，并對雜質和降解產(chǎn)物進行安全性評價。新藥研制部門對在合成、純化和貯存中實際存在的雜質和潛在的雜質，應采用有效的分離分析方法進行檢測。對于表觀含量在0.1%及其以上的雜質以及表觀含量在0.1%以下的具強烈生物作用的雜質或毒性雜質，予以定性或確證其結構。2．質量標準中雜質檢查項目的確定

對在穩(wěn)定性試驗中出現(xiàn)的降解產(chǎn)物，也應按上述要求進行研究。新藥質量標準中的雜質檢查項目應包括經(jīng)研究和穩(wěn)定性考察檢出的，并在批量生產(chǎn)中出現(xiàn)的雜質和降解產(chǎn)物，并包括相應的限度。除降解產(chǎn)物和毒性雜質外，在原料中已控制的雜質，在制劑中一般不再控制。原料藥和制劑中的無機雜質，應根據(jù)其生產(chǎn)工藝、起始原料情況確定檢查項目，但對于毒性無機雜質，應在質量標準中規(guī)定其檢查項。在仿制藥品的研制和生產(chǎn)中，如發(fā)現(xiàn)其雜質模式與其原始開發(fā)藥品不同或與已有法定質量標準規(guī)定不同，需增加新的雜質檢查項目的，應按上述方法進行研究，申報新的質量標準或對原質量標準進行修訂，并報有關藥品監(jiān)督管理部門審批。共存的異構體和抗生素多組分一般不作為雜質檢查項目，作為共存物質，必要時，在質量標準中規(guī)定其比例，以保證生產(chǎn)用的原料藥與申報注冊時的一致性。但當共存物質為毒性雜質時，該物質就不再認為是共存物質。單一對映體藥物，其可能共存的其他對映體應作為雜質檢查。消旋體藥物，當已有其單一對映體藥物的法定質量標準時，應在該消旋體藥物的質量標準中設旋光度檢查項目。3．雜質檢查分析方法和雜質的限度

雜質檢查分析方法應專屬、靈敏。雜質檢查應盡量采用現(xiàn)代分離分析手段，主成分與雜質和降解產(chǎn)物均能分開，其檢測限應滿足限度檢查的要求，對于需作定量檢查的雜質，方法的定量限應滿足相應的要求。雜質檢查分析方法的建立應按本藥典的要求作方法驗證。在研究時，應采用幾種不同的分離分析方法或不同測試條件以便比對結果，選擇較佳的方法作為質量標準的檢查方法。雜質檢查分析方法的建立，應考慮普遍適用性，所用的儀器和試材應容易獲得。對于特殊試材，應在質量標準中寫明。在雜質分析的研究階段，可用可能存在的雜質、強制降解產(chǎn)物，分別或加入主成分中，配制供試溶液進行色譜分析，調整色譜條件，建立適用性要求，保證方法專屬、靈敏。新藥研究中的雜質和降解產(chǎn)物，或在非新藥中發(fā)現(xiàn)的新雜質和新降解產(chǎn)物，應進行分離純化制備或合成制備，以供進行安全性和質量研究。對確實無法獲得的雜質和降解產(chǎn)物，研制部門應在申報資料和質量標準起草說明中寫明理由。在用現(xiàn)代色譜技術對雜質進行分離分析的情況下，對已知雜質和毒性雜質，應使用雜質對照品進行定位，如無法獲得該對照品時，可用相對保留值進行定位。應使用多波長檢測器研究雜質在不同波長下的檢測情況，并求得在確定的一個波長下，已知雜質，特別是毒性雜質對主成分的相對響應因子。已知雜質或毒性雜質對主成分的相對響應因子在0.9～1.1范圍內(nèi)時，可以用主成分的自身對照法計算含量，超出0.9～1.1范圍時，宜用對照品對照法計算含量。也可用經(jīng)驗證的相對響應因子進行校正后計算。未知雜質的定量可用主成分自身對照品法進行計算。雜質定量計算方法應明確規(guī)定在質量標準中。一般，質量標準中還應有單個雜質限量和總雜質限量的規(guī)定。在用薄層色譜分析雜質時，可采用雜質對照品或主成分的梯度濃度溶液比對，雜質斑點進行半定量評估，質量標準中應規(guī)定雜質的個數(shù)及其限度。雜質斑點進行半定量評估，質量標準中應規(guī)定雜質的個數(shù)及其限度。由于色譜法雜質限度檢查受色譜參數(shù)設置值的影響較大，有關操作注意事項應在起草說明中寫明，必要時，可在質量標準中予以規(guī)定。雜質限度的制訂應考慮如下因素：雜質